儲(chǔ)運(yùn)條件：-20℃

產(chǎn)品組成

注： 1 U=1 Weiss unit

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

T4 DNA Ligase(Fast) 由攜帶 T4 噬菌體 gene 30 的大腸桿菌產(chǎn)生。 該酶催化雙螺旋 DNA 或 RNA 之間的 5'- 磷酸基團(tuán)和 3'- 羥基之間形成磷 酸二酯鍵。該酶在雙鏈 DNA、RNA 或者 DNA/RNA 復(fù)合物間可修復(fù)單鏈 缺刻 , 并且可以連接有粘性末端或者平末端的 DNA 片段，但對(duì)于單鏈核 酸無(wú)活性，主要用于限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物 DNA 片段克隆、基因定點(diǎn)突 變與 PCR 產(chǎn)物克隆、線性 DNA 自環(huán)化與修復(fù)雙鏈 DNA 缺刻。 T4 DNA Ligase(Fast) 需要 ATP 作為輔助因子，在室溫下完成粘性末端連接反應(yīng) 僅需 10 分鐘。

酶活單位定義

37℃條件下，1 Weiss unit 的酶在 20 min 內(nèi)催化 1 nmol 的 [32PPi] 轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚蕴课綉B(tài)。  1 Weiss unit 等同于約 200 個(gè)粘性末端連接反應(yīng)單 位（CEU） ，相當(dāng)于在 16℃條件下，30 min 內(nèi)連接 50% HindIII 消化后 的 λDNA 片段。

酶活檢測(cè)條件

酶活在如下反應(yīng)混合物中進(jìn)行測(cè)試：  66 mM Tris-HCl (pH 7.6) ，6.6 mM MgCl2 ，66 μM ATP ， 10 mM DTT ，3.3 μM [32PPi]。

質(zhì)量控制

核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)

37 ℃ 條 件 下， 將 200 U 的 T4 DNA Ligase(Fast) 與 1 μg 的 pUC19 DNA 中溫育 4 h，未檢測(cè)出由共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA 轉(zhuǎn)變?yōu)閹в?nbsp;缺刻的 DNA。

核酸外切酶殘留檢測(cè)

將酶液與雙鏈 DNA 底物在 37℃溫育 16  h，通過(guò) DNA 電泳檢測(cè) 雙鏈 DNA 底物無(wú)變化。

藍(lán)白斑測(cè)試

室溫條件下，使用 30 U T4 DNA Ligase(Fast) 連接 pUC57 DNA/ HindIII，pUC57 DNA/PstI 或 pUC57 DNA/SmaI 消化產(chǎn)物 1 h，然后用 E.coli XL1-Blue 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物，檢測(cè)到少于 1% 的白斑。

使用方法

1. DNA 插入片段連接至載體 DNA  （粘性末端連接）

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

② 充分混勻并瞬離，  22℃溫育 10 min；

③ 取 1~5 μl 的連接產(chǎn)物用于 50 μl 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失 活步驟。

2. DNA 插入片段連接至載體 DNA  （平末端連接）

① 于冰上配制如下反應(yīng)體系：

②充分混勻并瞬離，  22℃溫育 1 h；

③ 取 1~5 μl 的連接產(chǎn)物用于 50 μl 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，或者取 1~2 μl 用于 50 μl 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

注：如果連接反應(yīng)產(chǎn)物用于電轉(zhuǎn)化，應(yīng)使用離心柱或者氯仿抽提清潔 DNA 代替熱失 活步驟。