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Taq SYBR? Green qPCR Premix (Universal)

AS050038

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安諾倫（北京）生物科技有限公司

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Taq SYBR? Green qPCR Premix (Universal)

品牌

Annoron-安諾倫

貨號

AS050038

產(chǎn)品分類

PCR系列

研究領域

Taq SYBR? Green qPCR Premix

(Universal)

REF: AS050038

儲運條件

長期保存請于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個月，盡量避免反復凍融。

產(chǎn)品組成

組分	規(guī)格
Taq SYBR? Green qPCR Premix (Universal)	5× 1 ml

產(chǎn)品簡介

Taq SYBR? Green qPCR Premix 是 SYBR? Green I 嵌合染料法專用 qPCR 試劑，為 2× 預混液，包含除引物和 DNA 樣品以外的所有 qPCR 組分，可減少操作步驟，縮短加樣時間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動 Taq DNA 聚合酶，配合精心優(yōu)化的 Buffer 體系以及 PCR 反應促進因子，使產(chǎn)品具有特異性強、擴增效率高等特點，有效抑制非特異性擴增，可對寬廣濃度范圍的模板進行準確定量，獲得穩(wěn)定可靠的 qPCR 結(jié)果。

預混液中含有獨特校正染料，與一系列 qPCR 設備兼容，包括需要 ROX 校正的儀器，實驗操作過程中不需要額外添加染料來校正儀器。

使用方法

1. 使用注意

① 因 Mix 中預混有染料，其保存或反應體系配制過程應避免強光照射； ② 使用前上下顛倒輕輕混勻 Mix，請勿渦旋振蕩混勻，避免產(chǎn)生過多氣泡 ;

③ Mix 中含有 Universal 校正染料，適用于所有機型，無需額外添加染料。

2. 建議的 qPCR 反應體系

試劑	使用量	終濃度
Taq SYBR? Green qPCR Premix	10 μl	1×
正向引物 (10 μM)a	0.4 μl	0.2 μM
反向引物 (10 μM)a	0.4 μl	0.2 μM
DNA 模板 b	X μl	10~200 ng/20 μl
Nuclease-Free Water	To 20 μl

a. 通常推薦的引物終濃度為 0.2 μM，反應效果不佳時可在 0.1~1 μM 范圍內(nèi)進行調(diào)整；

b. 推薦模板加樣量為 1~2 μl，如模板類型為未稀釋 cDNA 原液，模板添加量不應超過總反應體系的 10%。不同種類 DNA 模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同，必要時可進行梯度稀釋，以確定最佳的 DNA 模板添加量。

3. qPCR 反應程序（可根據(jù)機型適當調(diào)整）

兩步法

步驟	溫度	時間
預變性	95℃	30 sec
變性	95℃	10 sec
退火 & 延伸 a	60℃	30 sec
熔解曲線 b	使用儀器默認采集程序

三步法

步驟	溫度	時間
預變性	95℃	30 sec
變性	95℃	10 sec
退火 a	55~65℃	10 sec
延伸 a	72℃	30 sec
熔解曲線 b	使用儀器默認采集程序

a. 根據(jù)引物的 Tm 值進行退火 & 延伸（退火）溫度的設定；若擴增片段在 200 bp 以內(nèi)，退火 & 延伸（延伸）時間可以設置為 15 sec；此外，退火 & 延伸（延伸）時間的設置還需根據(jù)您使用的 qPCR 儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整；

b. 不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認的熔解曲線采集程序。

4. 實驗優(yōu)化

若使用默認反應條件反應性能不佳時，則需要進行反應條件的優(yōu) 化，可以從引物濃度以及擴增程序兩個方面進行：

① 引物濃度調(diào)整

當引物終濃度在 0.1~1.0 μM 范圍之間變化時，引物濃度越低，擴增特異性越高，但擴增效率會有所下降。

② 擴增程序優(yōu)化

需提高擴增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴增效率，可使用三步法程序或延長延伸時間。

5. 引物設計原則

① 擴增產(chǎn)物長度建議控制在 80~200 bp；

② 引物長度為 18~25 bp；

③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超過 1℃為佳，Tm 值控制在 58~62℃為佳；

④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之間；

⑤ 引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻，避開 T/C 或者 A/G 的連續(xù)結(jié)構(gòu)（特別是 3' 端）；

⑥ 引物 3' 端最后一個堿基最好為 G 或者 C；

⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補序列；

⑧ 使用 NCBI BLAST 功能檢索確認引物的特異性。

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