a. 根據(jù)引物的 Tm 值進行退火 & 延伸(退火) 溫度的設(shè)定;若擴增片段在 200 bp 以內(nèi), 退火 & 延伸(延伸)時間可以設(shè)置為 15 sec;此外, 退火 & 延伸(延伸) 時間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的 qPCR 儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整;
b. 不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別, 一般可使用儀器默認的熔解曲線 采集程序。
4. 實驗優(yōu)化
若使用默認反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時,則需要進行反應(yīng)條件的優(yōu) 化,可以從引物濃度以及擴增程序兩個方面進行:
① 引物濃度調(diào)整
當引物終濃度在 0.1~1.0 μM 范圍之間變化時,引物濃度越低, 擴增特異性越高,但擴增效率會有所下降。
② 擴增程序優(yōu)化
需提高擴增特異性,可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高 擴增效率,可使用三步法程序或延長延伸時間。
5. 引物設(shè)計原則
① 擴增產(chǎn)物長度建議控制在 80~200 bp;
② 引物長度為 18~25 bp;
③ 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超過 1℃為佳,Tm 值控制在 58~62℃為佳;
④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之間;
⑤ 引物 A、G、C、T 整體分布盡量要均勻,避開 T/C 或者 A/G 的連 續(xù)結(jié)構(gòu)(特別是 3' 端);
⑥ 引物 3' 端最后一個堿基最好為 G 或者 C;
⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補序列;
⑧ 使用 NCBI BLAST 功能檢索確認引物的特異性。
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