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Taq SYBR? Green qPCR Premix (Universal)

AS050038
貨號 貨期 規(guī)格 / 價格 詢價

Taq SYBR? Green qPCR Premix (Universal)

品牌

Annoron-安諾倫

貨號

AS050038

產(chǎn)品分類

PCR系列

研究領(lǐng)域

Taq SYBR?  Green qPCR Premix

(Universal)

REF: AS050038

 

 

 

儲運條件

長期保存請于 -20℃避光保存,Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放 一個月,盡量避免反復凍融。

 

產(chǎn)品組成

 

組分

規(guī)格

Taq SYBR?  Green qPCR Premix (Universal)

 1 ml

 

產(chǎn)品簡介

Taq SYBR?  Green qPCR Premix  SYBR?   Green I 嵌合染料法 專用 qPCR 試劑,為 2× 預混液,包含除引物和 DNA 樣品以外的所  qPCR 組分,可減少操作步驟,縮短加樣時間,降低污染幾率。其 核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動 Taq DNA 聚合酶,配合精心優(yōu)化的 Buffer 體系以及 PCR 反應(yīng)促進因子, 使產(chǎn)品具有特異性強、擴增效 率高等特點,有效抑制非特異性擴增,可對寬廣濃度范圍的模板進行 準確定量,  獲得穩(wěn)定可靠的 qPCR 結(jié)果。

預混液中含有獨特校正染料,與一系列 qPCR 設(shè)備兼容,包括需要 ROX 校正的儀器,實驗操作過程中不需要額外添加染料來校正儀器。

 

使用方法

1. 使用注意

①  Mix 中預混有染料, 其保存或反應(yīng)體系配制過程應(yīng)避免強光照射; ② 使用前上下顛倒輕輕混勻 Mix, 請勿渦旋振蕩混勻, 避免產(chǎn)生過多 氣泡 ;

③ Mix 中含有 Universal  校正染料, 適用于所有機型, 無需額外添加 染料。

 

2. 建議的 qPCR 反應(yīng)體系

 

試劑

使用量

終濃度

Taq SYBR?  Green qPCR Premix

10 μl

正向引物 (10 μM)a

0.4 μl

0.2 μM

反向引物 (10 μM)a

0.4 μl

0.2 μM

DNA 模板 b

X μl

10~200 ng/20 μl

Nuclease-Free Water

To 20 μl

 

a. 通常推薦的引物終濃度為 0.2 μM,反應(yīng)效果不佳時可在 0.1~1 μM 范圍內(nèi)進 行調(diào)整;

b. 推薦模板加樣量為 1~2 μl,如模板類型為未稀釋 cDNA 原液,模板添加量不 應(yīng)超過總反應(yīng)體系的 10%。不同種類 DNA 模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同, 必要時可進行梯度稀釋,以確定最佳的 DNA 模板添加量。

 

 

 

 

3. qPCR 反應(yīng)程序(可根據(jù)機型適當調(diào)整)

兩步法

 

步驟

溫度

時間

預變性

95

30 sec

變性

95

10 sec

退火 & 延伸 a

60

30 sec

熔解曲線 b

使用儀器默認采集程序

 

三步法

 

步驟

溫度

時間

預變性

95

30 sec

變性

95

10 sec

退火 a

55~65

10 sec

延伸 a

72

30 sec

熔解曲線 b

使用儀器默認采集程序



a. 根據(jù)引物的 Tm 值進行退火 & 延伸(退火) 溫度的設(shè)定;若擴增片段在 200  bp 以內(nèi), 退火 & 延伸(延伸)時間可以設(shè)置為 15 sec;此外, 退火 & 延伸(延伸) 時間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的 qPCR 儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時間自行調(diào)整;

b. 不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別, 一般可使用儀器默認的熔解曲線 采集程序。

 

4. 實驗優(yōu)化

若使用默認反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時,則需要進行反應(yīng)條件的優(yōu) 化,可以從引物濃度以及擴增程序兩個方面進行:

 引物濃度調(diào)整

當引物終濃度在 0.1~1.0 μM 范圍之間變化時,引物濃度越低, 擴增特異性越高,但擴增效率會有所下降。

 擴增程序優(yōu)化

需提高擴增特異性,可使用兩步法程序或提高退火溫度;需提高 擴增效率,可使用三步法程序或延長延伸時間。

5. 引物設(shè)計原則

 擴增產(chǎn)物長度建議控制在 80~200 bp

 引物長度為 18~25 bp;

 正向引物和反向引物的 Tm 值相差不超過 1℃為佳,Tm 值控制在 58~62℃為佳;

 引物的 GC 含量控制在 40%~60% 之間;

 引物 A、G、CT 整體分布盡量要均勻,避開 T/C 或者 A/G 的連 續(xù)結(jié)構(gòu)(特別是 3' );

 引物 3' 端最后一個堿基最好為 G 或者 C;

 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補序列;

 使用 NCBI BLAST 功能檢索確認引物的特異性。

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