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癌癥的研究和治療一直是世界性的難題，近年來隨著生活和環(huán)境的問題，癌癥的發(fā)病率逐年升高。2016年，國家癌癥中心赫捷院士和全國腫瘤登記中心陳萬青教授等調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果估計，中國2015年估計有429.2萬例癌癥新發(fā)病例，281.4萬例癌癥死亡[1]，平均每分鐘就有8人確診癌癥，每分鐘5人死于癌癥。

近幾年腫瘤免疫治療接連創(chuàng)造癌癥“臨床治愈”的奇跡，成為抗?fàn)幇┌Y的“強(qiáng)心劑”。而其中備受大家關(guān)注并廣泛應(yīng)用于臨床的是免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1/PD-L1免疫療法[2,3]。

PD-1/PD-L1相當(dāng)于機(jī)體的“接頭暗號”，PD-1是活化免疫T細(xì)胞的“天王蓋地虎”，PD-L1是抗原呈遞細(xì)胞的“寶塔鎮(zhèn)河妖”，暗號一旦對接成功，免疫T細(xì)胞就認(rèn)為是“自己人”而不發(fā)生攻擊。這本來是人類進(jìn)化中的“神來之筆”，但是狡詐的癌癥細(xì)胞破解了機(jī)體“暗語”，遇到免疫T細(xì)胞就喊“寶塔鎮(zhèn)河妖”，讓免疫T細(xì)胞誤認(rèn)為其是“自己人”。

然而，PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)阻斷在大部分癌癥患者中是沒有持續(xù)的臨床治療效果的[4]，因此研究是否有其他藥物與PD-1抑制劑聯(lián)合使用的免疫治療策略已經(jīng)成為一種趨勢。

來自博德研究所的John G. Doench教授和W. Nicholas Haining教授應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，在小鼠移植腫瘤模型中篩選抵抗和敏感于腫瘤免疫治療的基因，找到腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)Ptpn2。這一發(fā)現(xiàn)于7月19日發(fā)表在Nature雜志上[5]。

 John G. Doench                                                  W. Nicholas Haining

1. 體內(nèi)篩選策略發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞逃避免疫治療的已知基因和潛在機(jī)制

為了篩選到導(dǎo)致癌癥逃避免疫治療的可能基因，作者首先設(shè)計了靶向2,368個基因的9,872個gRNA，包裝成慢病毒，感染過表達(dá)casp蛋白的黑色素瘤細(xì)胞；然后把這些細(xì)胞移植到Tcra?/?小鼠（缺失CD4+和CD8+細(xì)胞）或者野生型小鼠體內(nèi)，野生型小鼠然后給予GVAX或者GVAX聯(lián)合PD-1抗體處理；最后對各組測序進(jìn)行基因比對，找到可能的靶基因（圖1a，1b）。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個已知基因PD-L1和CD47（圖1c，1d），證明這個體系是有效的。

進(jìn)一步作者分析了在免疫治療組明顯富集的gRNA靶向敲除基因，這些基因可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞抵抗免疫治療的潛在機(jī)制。結(jié)果提示干擾素通路對于腫瘤免疫治療是非常重要的（圖1e-1h）。

圖1 體內(nèi)篩選策略發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞逃避免疫治療的已知基因和潛在機(jī)制

2. 篩選腫瘤免疫治療的潛在靶基因

   作者分析在免疫治療組明顯缺失的gRNA靶向敲除基因，這些基因可能是促進(jìn)免疫治療的潛在基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因主要分布在1.TNF/NF-kB通路；2. 抗原呈遞系統(tǒng)；3. 激酶抑制信號系統(tǒng)；4. 泛素-蛋白酶體通路（圖2a）。四個通路中分布篩選到四個差異最明顯的基因Ptpn2，H2-T23，Ripk1，Stub1（圖2b-2e）。

圖2 篩選腫瘤免疫治療的潛在靶基因

3. Ptpn2基因敲除使腫瘤細(xì)胞對免疫治療更加敏感

作者下一步研究主要集中在Ptpn2基因。當(dāng)Ptpn2基因被敲除后GVAX聯(lián)合PD-1抗體免疫治療的效果更加明顯（圖3a，3b）；當(dāng)Ptpn2基因敲除細(xì)胞重新正常表達(dá)或者過表達(dá)Ptpn2會抵抗GVAX聯(lián)合PD-1抗體的免疫治療（圖3c，3d）。綜合所有結(jié)果提示Ptpn2基因是腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

圖3 Ptpn2基因敲除使腫瘤細(xì)胞對免疫治療更加敏感

4. Ptpn2基因敲除增加腫瘤抗原提呈

Ptpn2基因敲除可以使腫瘤細(xì)胞對免疫治療更加敏感，那么其潛在的機(jī)制是什么呢? 為了找到其機(jī)制，作者應(yīng)用流式技術(shù)對Ptpn2基因敲除和對照組腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞進(jìn)行分類檢測，發(fā)現(xiàn)在Ptpn2基因敲除組的微環(huán)境中CD8陽性和??陽性T細(xì)胞明顯增多（圖4a-4c）。進(jìn)一步作者在Ptpn2基因敲除組和對照組過表達(dá)腫瘤抗原卵清白蛋白（OVA），然后和CD8陽性T細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Ptpn2基因敲除促進(jìn)腫瘤細(xì)胞抗原提呈和對CD8陽性T細(xì)胞毒性的敏感（圖4d-4f）。

圖4 Ptpn2基因敲除增加腫瘤抗原提呈

5. Ptpn2基因敲除使腫瘤細(xì)胞對干擾素通路更加敏感

之前的研究發(fā)現(xiàn)Ptpn2可以通過抑制JAK1和 STAT1的磷酸化負(fù)向調(diào)控干擾素信號通路[6,7]，那么Ptpn2敲除導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對免疫治療更加敏感是否是通過干擾素信號通路呢？研究發(fā)現(xiàn)Ptpn2敲除后STAT1的磷酸化明顯增強(qiáng)（圖5a），干擾素刺激下干擾素下游基因表達(dá)明顯升高（圖5b，5c）并且腫瘤的增長明顯受到抑制（圖5d，5e）。

當(dāng)在Ptpn2基因敲除的腫瘤細(xì)胞中同時敲除干擾素的基因Stat1等，明顯減弱了由于Ptpn2基因敲除導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對免疫治療的敏感性（圖5g，5h）。這些結(jié)果提示Ptpn2基因是通過干擾素信號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞對免疫治療的敏感性。

圖5 Ptpn2基因敲除使腫瘤細(xì)胞對干擾素通路更加敏感

本研究通過運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)，篩選黑色素瘤中了除PD-1/PD-L1和CD47之外新的腫瘤免疫治療新潛在靶點(diǎn)Ptpn2，為其它腫瘤的腫瘤免疫治療提供了新的策略和希望。

本研究還篩選到了其它潛在3個基因，其中泛素化-蛋白酶體信號通路Ripk1參與炎癥NF-kB信號通路，因此調(diào)控Ripk1的水平也成為腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

[1] Chen, W. et al. Cancer statistics in China, 2015. CA: a cancer journal for clinicians 66, 115-132, doi:10.3322/caac.21338 (2016).

[2] Reck, M. et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England journal of medicine 375, 1823-1833, doi:10.1056/NEJMoa1606774 (2016).

[3] Wolchok, J. D. et al. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. The New England journal of medicine 369, 122-133, doi:10.1056/NEJMoa1302369 (2013).

[4] Zaretsky, J. M. et al. Mutations Associated with Acquired Resistance to PD-1 Blockade in Melanoma. The New England journal of medicine 375, 819-829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016).

[5] Manguso, R. T. et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature, doi:10.1038/nature23270 (2017).

[6] Kleppe, M. et al. PTPN2 negatively regulates oncogenic JAK1 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood 117, 7090-7098, doi:10.1182/blood-2010-10-314286 (2011).

[7] Kleppe, M. et al. Deletion of the protein tyrosine phosphatase gene PTPN2 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Nature genetics 42, 530-535, doi:10.1038/ng.587 (2010).