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免疫組織化學(xué)（IHC）是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定位組織和細(xì)胞中的某些化學(xué)物質(zhì)的一門(mén)技術(shù)，從技術(shù)上說(shuō)，IHC實(shí)驗(yàn)并不難，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有許多變量，容易遇到各種各樣的問(wèn)題。

下面為大家列出了IHC實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題，以及相應(yīng)的解決對(duì)策。

Q1：邊緣效應(yīng)？

　1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴(lài)氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。

　2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

Q2：產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？

　1）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。

　2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

　3）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色。

　4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果。

　5）DAB孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高。

　6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要。

　7）標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

Q3：免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些？

　1）抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng)，必須摸索最佳濃度。

　2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)。

　3）組織切片本身這種抗原含量低。

　4）血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

　5）DAB孵育時(shí)間過(guò)短。

　6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。

　7）開(kāi)始做免疫組化，一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。

Q4：背景強(qiáng)的原因？

　1）考慮一抗?jié)舛雀摺?/span>

　2）然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間。

　3）也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短。

　4）適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。

Q5：石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象？

　1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度。

　2）用含有多聚賴(lài)氨酸的玻片，可以購(gòu)買(mǎi)到或這自己做。

　3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織。

　4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。

Q6：一抗從4度拿出后，為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？

　1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片。

　2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對(duì)表達(dá)較弱的抗原可能有用，4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

Q7：切片染色后背景太深，如何區(qū)分特異性與非特異性著色？

　全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：

　1）抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。

　2）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

　3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

　4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAPPen在組織周?chē)?huà)圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

　5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4?C冰箱過(guò)夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。

　6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買(mǎi)的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。

Q8：脫片產(chǎn)生的原因有哪些？

　1）多聚賴(lài)氨酸玻片質(zhì)量的問(wèn)題。

　2）組織切的不好，切片機(jī)的問(wèn)題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

　3）沒(méi)烤好，時(shí)間短，溫度不夠之類(lèi)。

　4）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

　5）修復(fù)的問(wèn)題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒(méi)辦法，只有從另外的問(wèn)題上著手。

　6）一旦見(jiàn)到有組織漂起來(lái)操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

　7）組織的問(wèn)題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類(lèi)越容易脫。

Q9：DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？

 1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

 2）有可能是你顯色液底物加到片子上后沒(méi)有搖勻，造成局部底物濃度不一致，所以加完顯色液后最好將片子來(lái)回左右晃動(dòng)幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。

 3）如果你的片子是中間的染色深，靠近邊上的淺，那有可能是你蠟圈畫(huà)的太小，顯色液覆蓋的面積不過(guò)大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng)。最外側(cè)的組織片最好離顯色液外緣0.5cm。

Q10：染色過(guò)強(qiáng)

　1）抗體的濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）。

　2）孵育溫度過(guò)高。

　3）DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或DAB濃度過(guò)高，顯色時(shí)間不能超過(guò)5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)。　

Q11：非特異性背景染色

　1）操作過(guò)程中沖洗不充分。

　2）組織中含過(guò)氧化物酶未阻斷，可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時(shí)間延長(zhǎng)。

　3）組織中含內(nèi)源性生物素，可用正常非免疫動(dòng)物血清再封閉。

　4）血清蛋白封閉不充分，可延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間?！?/span>

Q12：染色弱

　1）抗體濃度過(guò)低，孵育時(shí)間過(guò)短，可提高抗體濃度，孵育時(shí)間不能少于60分鐘。

　2）試劑超過(guò)有效使用期及時(shí)更換試劑。

　3）操作中，滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋?zhuān)擅坎降渭釉噭┣盀r干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）。

　4）室溫太低，低于15℃若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過(guò)夜）。

　5）蛋白封閉過(guò)度，封閉時(shí)間不要超過(guò)10分鐘。

Q13：染色陰性

　1）操作步驟錯(cuò)誤重新試驗(yàn)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。

　2）組織中無(wú)抗原設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　3）一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無(wú)誤。