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什么是熒光原位雜交技術(shù)？

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是根據(jù)已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，檢測該特異微生物種群的存在與豐度。

熒光原位雜交技術(shù)的背景及優(yōu)勢

熒光原位雜交技術(shù)問世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來隨著FISH所應(yīng)用的探針鐘類的不斷增多，特別是全Cosmid探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使FISH技術(shù)不僅在細(xì)胞遺傳學(xué)方面，而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究，如基因診斷基因定位等 。

原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較長的曝光時間和對環(huán)境的污染等。

此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數(shù)上的誤差等。與之比FISH則具有：

①操作操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年；

②方法敏感，能迅速得到結(jié)果；

③在同一標(biāo)本上，可同時檢測幾種不同探針；

④不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究等特點(diǎn)。

熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。

將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。

雖然FISH具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是該技術(shù)操作相對復(fù)雜，以下總結(jié)了該項(xiàng)操作的注意事項(xiàng)及常見問題。

1、開展FISH所需要的實(shí)驗(yàn)條件和人員培訓(xùn)建立

FISH技術(shù)平臺，除需要一間可以進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)操作和顯微觀察暗室外，還需要原位雜交儀、熒光顯微鏡、顯微鏡濾光片、水浴箱、漩渦混合器、普通離心機(jī)、移液器、FISH探針試劑盒、無水乙醇、二甲苯、去離子水、橡膠水泥、透明指甲油等設(shè)備和試劑。

由于FISH檢測具有敏感性和客觀性，任何一個步驟的微小失誤均有可能對結(jié)果的判讀產(chǎn)生偏差，進(jìn)而對臨床的合理用藥產(chǎn)生影響，因此就對操作的技術(shù)人員在熟練和規(guī)范程度做出更高的要求。

建議每一個開展分子病理檢測的病理科設(shè)置專門的分子病理室并由專人操作，并且要求專門的技術(shù)人員有相關(guān)的分子生物學(xué)理論知識，并經(jīng)過專門培訓(xùn)，有一定的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)。

2、固定液的選擇及固定時間

石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林固定6～48h，其它固定液對實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。

組織離體后應(yīng)盡快固定，建議在標(biāo)本離體后30min內(nèi)固定。如樣本固定不及時，熒光信號會減弱。

固定液的體積是組織體積的4～20倍，否則固定不充分，容易出現(xiàn)無信號或者信號很弱的現(xiàn)象。

而且，為了保證信號的準(zhǔn)確性，蠟塊最好在2年內(nèi)進(jìn)行檢測，已經(jīng)切好的切片在6周內(nèi)檢測最佳。

3、組織切片和載玻片的選擇

組織切片4～5μm 厚，過厚或過薄的切片均會對信號的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響，而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會在預(yù)處理時掉片。

載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實(shí)驗(yàn)室可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。

4、實(shí)驗(yàn)過程中切片的預(yù)處理

切片預(yù)處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。當(dāng)組織處理不規(guī)范、切片過厚或烤片不足時，在煮沸過程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過夜。

煮沸過程中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)溫度和時間。酶消化是 FISH 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，如果對組織不熟悉，可以先消化推薦的反應(yīng)時間，然后復(fù)染 DAPI在熒光顯微鏡下觀察，在DAPI通道下，以細(xì)胞既無空洞(消化過度)，亦無明顯的云霧狀(消化不足)為最佳，同時可切換觀察紅綠通道，以紅綠通道無明顯的背景為佳，如果背景較高，可適當(dāng)延長消化時間。

另外，對于陳舊的石蠟組織切片，要適當(dāng)延長消化時間，否則會出現(xiàn)大量的自發(fā)熒光。若消化不足所致 FISH 信號減弱或丟失，消化良好時FISH信號較好。

5、變性和雜交

變性和雜交是本實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟，變性的時間和溫度是雜交成功是否的關(guān)鍵，為保證變性期間溫度的穩(wěn)定，建議采用專業(yè)的原位雜交儀進(jìn)行變性和雜交步驟，不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)的繁瑣性，而且更有利于實(shí)驗(yàn)條件的控制，比如時間、溫度和避光條件等。為避免雜交液在變性和雜交過程中的損失和防止干片，一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進(jìn)行密封。

6、雜交后洗滌溫度、時間和封片保存

雜交后的洗滌對于整個實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響非常重要，首先應(yīng)保證正確配置雜交洗滌液，洗滌液溫度偏高或時間過長，可導(dǎo)致信號減弱，洗滌液溫度偏低或者時間過短，會產(chǎn)生雜信號過多、紅綠信號對比性差或者特異性低等情況。

在復(fù)染完 DAPI 以后，加蓋蓋玻片，用指甲油固定住蓋玻片四角，這樣可以防止在油鏡下觀察時蓋玻片脫落。由于熒光信號容易淬滅，所以在染色后應(yīng)立即觀察，如果當(dāng)時不能觀察，可將切片放入切片盒中，保存于－20℃冰箱里2周以內(nèi)。

7、設(shè)置對照

每次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對照: 實(shí)驗(yàn)室在每一輪檢測中均應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化對照材料( 陽性、陰性和可疑)。如果對照材料沒有顯示預(yù)期的結(jié)果，則不能對結(jié)果做出判定。

8、結(jié)果判讀

應(yīng)選擇細(xì)胞核大小一致、核邊界完整、DAPI染色均一、細(xì)胞核無重疊、信號清晰的細(xì)胞。隨機(jī)計數(shù)至少20個浸潤性癌細(xì)胞核中的雙色信號。判讀標(biāo)準(zhǔn)參考《乳腺癌 HER-2檢測指南(2014版)》，對于FISH結(jié)果不確定的病例，需要再計算20個細(xì)胞核中的信號或由另外一位病理診斷醫(yī)師重新計數(shù)。

如仍為臨界值，則應(yīng)行免疫組化檢測(若FISH檢測前未行)，也可以選取不同的組織塊重新檢測。HER-2 FISH 檢測在我國發(fā)達(dá)地區(qū)的三級醫(yī)院已普遍開展，針對HER-2過表達(dá)的曲妥珠單抗在我國已上市多年，檢測的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果的正確判讀，對于正確選擇合適的患者，指導(dǎo)臨床治療顯得尤為重要。

國家在大力推廣FISH檢測方法的同時，還需制定統(tǒng)一的HER-2基因檢測的報告指南及早日進(jìn)行質(zhì)量化認(rèn)證，以保證各醫(yī)院之間的結(jié)果相對一致，更好的服務(wù)于患者。