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RNA干擾整體實(shí)驗(yàn)服務(wù)—RNAi基因干擾

RNA干擾（RNAi基因干擾、SiRNA實(shí)驗(yàn)）：RNA干擾（RNA interfering，RNAi）現(xiàn)象是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(DsRNA)引發(fā)的基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，小干擾RNA特異性介導(dǎo)相同序列的mRNA降解，阻斷相應(yīng)基因表達(dá)。艾柏森生物提供的RAN干擾技術(shù)包括化學(xué)合成小RNA片段（SiRNA）和構(gòu)建載體RNA（SnRNA）兩種形式。實(shí)驗(yàn)委托者只需提供干預(yù)基因名稱或基因序列ID，艾柏森生物免費(fèi)設(shè)計(jì)合適的干預(yù)位點(diǎn)，保證至少有一對(duì)小RNA有效抑制目的基因表達(dá)，抑制效率不低于70%。

RNA干擾（SiRNA實(shí)驗(yàn)）流程
第一步 確定干擾基因，設(shè)計(jì)并合成合適的小干擾RNA（片段型或載體型小干擾RNA）。
第二步  預(yù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，摸索轉(zhuǎn)染條件、時(shí)間并進(jìn)行必要的檢測(cè)（WB、PCR等），確定干預(yù)效果最佳的一對(duì)小RNA。
第三步  正式實(shí)驗(yàn)，設(shè)置合理實(shí)驗(yàn)分組，進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
第四步  轉(zhuǎn)染后檢測(cè)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)、蛋白檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)等。以研究小干擾RNA對(duì)于細(xì)胞、蛋白或基因功能的影響。

RNA干擾（SiRNA實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)（可根據(jù)委托者實(shí)驗(yàn)需求選擇做）
1. 細(xì)胞檢測(cè)：細(xì)胞增殖毒性MTT、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲；
2. 蛋白檢測(cè)：免疫印跡WB、免疫細(xì)胞化學(xué)ICC、免疫熒光IF、流式細(xì)胞術(shù)FCM、酶聯(lián)免疫ELSIA；
3. 分子生物檢測(cè)：RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、甲基化特異性PCR(MSP)；
4. 其他檢測(cè)：生化檢測(cè)、酶類檢測(cè)、脂類檢測(cè)、糖類檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)案例： YYYY細(xì)胞在XXXX基因干擾后的增殖及侵襲能力實(shí)驗(yàn)
第一部分：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞篩選
一、免疫熒光實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)試劑：PBS(磷酸鹽緩沖液pH7.4)，非免疫山羊血清，Triton X-100，BSA抗體稀釋液，XXXX蛋白一抗 (1:100)，二抗AlexaFluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫熒光（IF）染色：倒出細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗三次；2-4%甲醛固定15分鐘；1×PBS緩沖液（0.01 M，pH7.4）洗滌3次，每次5分鐘；滴加非免疫山羊血清（內(nèi)含0.3%Triton X-100）封閉液,覆蓋液面2-3mm,室溫放置60min，甩去多余液體；滴加一抗plscr1 50μL（1:100），4℃過夜；PBS洗3次，每次5分鐘；滴加熒光標(biāo)記的上述二抗50μL（1：200），室溫 60分鐘；PBS洗3次各5min；熒光顯微鏡下觀察、拍照，每指標(biāo)照相2套圖像。
IF染色結(jié)果（400倍）: 通過熒光染色可以分析出，XXXX蛋白在YYYY細(xì)胞中表達(dá)量最突出。

YYYY細(xì)胞

BBBB細(xì)胞

    

CCCC細(xì)胞

二、RT-PCR實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞樣品4份，分組編號(hào)（見圖片標(biāo)示）
試劑：TrizolReagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026；ReverTraAce-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO#FSK-100；PCR Master Mix（2x） Fermentas # K0172；DNA Marker DL2，000， TaKaRa D501A；0.1%DEPC水、氯仿（分析純）、異丙醇（分析純）75%乙醇；AGAROSE(瓊脂糖)  AMRESCO，K499；10×DNA上樣緩沖液, 美國ProMab,SJ-R2008523；0.5mg/ml EB 溶液，實(shí)驗(yàn)室常備；1×TBE, 實(shí)驗(yàn)室常備，配方參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第二版》
儀器：PCR儀,ABI9600；電泳儀，北京六一儀器公司，DYCP-31DN型；高速離心機(jī)，湘儀H1650-W； 紫外分光光度計(jì)，上海江儀儀器有限公司，UV-7502C(751)；成像系統(tǒng)，柯達(dá)紫外顯相系統(tǒng) 400W像素
引物資料：
Homo- XXXX-F    5-cacccatgtctaccaaagtt -3，Homo-XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3，片段長(zhǎng)度: 175bp
Homo-GAPDH-F  5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，Homo-GAPDH-R  5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，片段長(zhǎng)度   450bp
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA提?。?/span>每樣本加入1mlTrizol試劑消化(組織約50mg—100mg充分剪碎，細(xì)胞約106—107)；勻漿樣品在室溫靜置5~10min后加入0.2倍體積的氯仿，震蕩15秒后在2~8℃下12,000×g離心15min；將水樣層轉(zhuǎn)移至干凈的試管，加入0.5倍體積的異丙醇，混勻后-20℃下靜置10-15min，在2~8℃下12,000×g離心10min；移去上層懸液，將RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗滌，在震蕩器上混勻后2~8℃下7,500×g離心5min，棄去上清液；適度干燥RNA沉淀后，加入適量0.1% DEPC水，使RNA完全溶解；2000rpm離心20sec
2、總 RNA 定量：紫外分光光度計(jì)開機(jī)預(yù)熱30 min；用蒸餾水洗滌石英比色皿，吸水紙吸干，加入DEPC水后，放入樣品室的S池架上，關(guān)上蓋板；設(shè)定紫外光波長(zhǎng)（260nm、280nm）后校零（每次檢測(cè)前均需調(diào)零）；將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（RNA 1μl用DEPC水稀釋至250μl）后，記錄編號(hào)和稀釋度；把裝有稀釋后待測(cè)樣品的比色皿放進(jìn)樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板；分別測(cè)定260nm和280nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值（吸光度在0.1—0.5范圍為最佳）；用蒸餾水洗滌石英比色皿，酒精浸泡。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷：純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 純RNA：OD260/OD280≈2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）

計(jì)算A260/ A280比值，比值≥1.8，滿足實(shí)驗(yàn)要求。        
RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟：略
產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,加樣量為10μl（DNA樣本8μl+上樣緩沖液2μl） ,電壓120V ,電泳完畢后在溴化乙錠( EB)中染色約15分鐘，清水漂洗后凝膠成像系統(tǒng)拍照。
凝膠圖片與平均光密度值：陽性條帶以Gelpro4.0 版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其IOD值。

點(diǎn)樣說明及IOD參考值分析：

R值為目的基因PLSCR1參考IOD值/內(nèi)參基因GAPDH參考IOD值
XXXX基因在YYYY細(xì)胞中表達(dá)量最突出。

三、WB實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)試劑：XXXX蛋白多抗(1:400)，37Ka；GAPDH單抗（1:1000）,37Ka；RabbitAnti Goat IgG/HRP（1:30,000）；GoatAnti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程：略
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：陽性條帶以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其IOD（integrated optical density）累積光密度參考值。

XXXX蛋白在YYYY細(xì)胞中表達(dá)量最高。
通過上述實(shí)驗(yàn)，確定有YYYY細(xì)胞來進(jìn)行XXXX基因沉默實(shí)驗(yàn)最具意義。