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RNA干擾整體實(shí)驗(yàn)服務(wù)—SiRNA實(shí)驗(yàn)
第二部分：細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染以及siRNA的篩選
一、細(xì)胞培養(yǎng)
使用10％胎牛 DMEM培養(yǎng)液，37℃下置于5％CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞融合至80％，用0．25％胰酶消化傳代后接種(細(xì)胞密度5 XlO4)于培養(yǎng)瓶或孔板，待細(xì)胞融合至約70％后用于實(shí)驗(yàn)。以下圖片均用顯微鏡100X拍照
1）細(xì)胞培養(yǎng)方法：略
二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
材料：YYYY細(xì)胞；XXXX基因siRNA（20Μm, 合成）；Lipofectamine 2000試劑（使用前貯存在+4℃）；Opti-MEM I 低血清培養(yǎng)基（使用前37℃預(yù)熱）；6孔組織培養(yǎng)板
轉(zhuǎn)染步驟：使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染前一天，4-5×104細(xì)胞接種在6孔板上，2mL含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70%；按照如下的方法準(zhǔn)備siRNA- Lipofectamine 2000復(fù)合物：a.以250ul Opti-MEM I稀釋5ul Lipofectamine 2000，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘。b.以250ulOpti-MEM I稀釋250pmol siRNA，輕輕混勻。c.孵育5分鐘后，混合稀釋的siRNA和稀釋的Lipofectamine 2000，輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以便允許復(fù)合物的形成。溶液可能出現(xiàn)混濁，但是這不會(huì)影響轉(zhuǎn)染；將siRNA - Lipofectamine 2000復(fù)合物加入到每一個(gè)包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中。通過(guò)輕輕地前后搖動(dòng)培養(yǎng)板混合；6小時(shí)后進(jìn)行FAM-siRNA熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染率；37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育48小時(shí)，進(jìn)行WB，real-time檢測(cè)。
轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)：
三、siRNA最佳濃度篩選
實(shí)驗(yàn)分組：A 正常組；B 陰性對(duì)照組；C XXXX-1轉(zhuǎn)染組；D XXXX-2轉(zhuǎn)染組；E XXXX-3轉(zhuǎn)染組
第一個(gè)篩選實(shí)驗(yàn)：熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)分組：
|
NO |
樣本編號(hào) |
|
1 |
A |
|
2 |
B |
|
3 |
C |
|
4 |
D |
|
5 |
E |
實(shí)驗(yàn)試劑：Trizol, Invitrogen ，#15596-026；RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas #K1631；Deoxyribonuclease I (DNase I), Fermentas #EN0521；RiboLock? Ribonuclease Inhibitor, Fermentas #EO0381；SYBR GreenPCR Master Mix，ABI 4309155；Realtime-PCR儀,ABI 7900型；引物由primer3.0軟件設(shè)計(jì),并由艾柏森生物合成。步驟(略)。
結(jié)果數(shù)據(jù)：Ct（基本循環(huán)數(shù)）；ΔCt（基本循環(huán)與內(nèi)參循環(huán)數(shù)差值）；ΔΔCt*（最低樣本ΔCt值—其它各樣本ΔCt值）；2-ΔΔCt（RQ） ：目的基因mRNA相對(duì)含量（* 相對(duì)定量以含量最低的樣本為標(biāo)準(zhǔn)，其余各樣本的含量均為相對(duì)該樣本的倍數(shù).具體方法參見(jiàn)Kenneth，et al. (2001) METHODS 25, 402–408）。
擴(kuò)增曲線：在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，熒光擴(kuò)增曲線主要分為4個(gè)特征性階段：基線期，指數(shù)期初期，指數(shù)期，平臺(tái)期，在軟件中顯示形狀是一條平滑的S型曲線。目的基因的擴(kuò)增曲線符合4個(gè)特征性階段的平滑的S型曲線，陰性對(duì)照(模板為水)無(wú)顯著熒光信號(hào)，提示熒光定量PCR反應(yīng)程序正常運(yùn)行，目的基因得到有效擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，試劑符合實(shí)驗(yàn)要求。
熔點(diǎn)曲線：從軟件中顯示形狀只有一個(gè)峰值，沒(méi)有出現(xiàn)雜峰，提示無(wú)非特異性熒光信號(hào)，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物單一，有利于結(jié)果分析。
|
Sample |
CT |
ΔCт |
ΔΔCт |
RQ |
RQ mean |
SD |
|
1 |
26.1312 |
5.7691 |
-2.2238 |
4.6712 |
4.4587 |
0.6585 |
|
1 |
26.3320 |
6.0975 |
-1.8954 |
3.7203 |
|
|
|
1 |
26.0145 |
5.6754 |
-2.3175 |
4.9847 |
|
|
|
2 |
27.0101 |
5.9786 |
-2.0143 |
4.0398 |
3.9841 |
0.0485 |
|
2 |
27.0077 |
6.0073 |
-1.9856 |
3.9603 |
|
|
|
2 |
27.0584 |
6.0103 |
-1.9826 |
3.9520 |
|
|
|
3 |
28.1032 |
8.3378 |
0.3449 |
0.7874 |
0.5186 |
0.2327 |
|
3 |
28.7212 |
9.3670 |
1.3741 |
0.3858 |
|
|
|
3 |
28.5034 |
9.3785 |
1.3856 |
0.3827 |
|
|
|
4 |
28.0210 |
7.8063 |
-0.1866 |
1.1381 |
1.3224 |
0.2119 |
|
4 |
28.0042 |
7.6421 |
-0.3508 |
1.2753 |
|
|
|
4 |
27.9142 |
7.3570 |
-0.6359 |
1.5539 |
|
|
|
5 |
26.3742 |
7.0578 |
-0.9351 |
1.9120 |
2.1770 |
0.3723 |
|
5 |
26.5004 |
6.6129 |
-1.3800 |
2.6027 |
|
|
|
5 |
26.6316 |
6.9812 |
-1.0117 |
2.0163 |
|
|
|
1-內(nèi)參 |
20.3621 |
|
||||
|
1-內(nèi)參 |
20.2345 |
|
||||
|
1-內(nèi)參 |
20.3391 |
|
||||
|
2-內(nèi)參 |
21.0315 |
|
||||
|
2-內(nèi)參 |
21.0004 |
|
||||
|
2-內(nèi)參 |
21.0481 |
|
||||
|
3-內(nèi)參 |
19.7654 |
|
||||
|
3-內(nèi)參 |
19.3542 |
|
||||
|
3-內(nèi)參 |
19.1249 |
|
||||
|
4-內(nèi)參 |
20.2147 |
|
||||
|
4-內(nèi)參 |
20.3621 |
|
||||
|
4-內(nèi)參 |
20.5572 |
|
||||
|
5-內(nèi)參 |
19.3164 |
|
||||
|
5-內(nèi)參 |
19.8875 |
|
||||
|
5-內(nèi)參 |
19.6504 |
|
||||
第二個(gè)篩選實(shí)驗(yàn)：WB實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)試劑：略
WB實(shí)驗(yàn)操作流程：略
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：陽(yáng)性條帶以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析，測(cè)其IOD（integrated optical density）累積光密度參考值。
|
Lanes: |
Lane 1 |
Lane 2 |
Lane 3 |
Lane 4 |
Lane 5 |
|
Rows |
(IOD) |
(IOD) |
(IOD) |
(IOD) |
(IOD) |
|
XXXX |
216.21 |
200.86 |
60.691 |
124.52 |
166.52 |
|
GAPDH |
299.62 |
295.32 |
293.13 |
307.85 |
312.45 |
|
樣本 |
A |
B |
C |
D |
E |
以上實(shí)驗(yàn)得出XXXX-1干預(yù)效果最好，可選擇做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
第三部分：細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附功能、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)分組：A 正常細(xì)胞培養(yǎng)組；B XXXX-1干預(yù)組
一、MTT方法檢測(cè)細(xì)胞毒性
原理：MTT分析法以代謝還原噻唑藍(lán)3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)為基礎(chǔ)?；罴?xì)胞的線粒體中存在與NADP相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色的甲月贊（Formazan），死細(xì)胞此酶消失，MTT不被還原。 用DMSO溶解Formazan后可用酶標(biāo)儀在570nm(450nm)波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度。
操作步驟：在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔（約1×104），置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)；加入適當(dāng)濃度的受試化合物；將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間；將5×MTT用 DilutionBuffer稀釋成1× MTT；每孔加50μL 1× MTT，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT還原為甲月贊；吸出上清液，每孔加150μL DMSO使甲月贊溶解，用平板搖床搖勻；酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。
結(jié)果分析：細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD-本地OD/對(duì)照細(xì)胞OD-本地OD）×100％。注：本底OD值（完全培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）
0h 570nm波長(zhǎng)各孔OD值：
|
實(shí)驗(yàn)分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.457 |
0.452 |
0.463 |
0.457 |
|
B |
0.461 |
0.448 |
0.454 |
0.454 |
|
本底 |
0.007 |
0.009 |
0.010 |
0.009 |
12h 570nm波長(zhǎng)各孔OD值：
|
實(shí)驗(yàn)分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.503 |
0.518 |
0.511 |
0.511 |
|
B |
0.494 |
0.501 |
0.489 |
0.495 |
|
本底 |
0.009 |
0.012 |
0.011 |
0.011 |
24h 570nm波長(zhǎng)各孔OD值：
|
實(shí)驗(yàn)分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.618 |
0.607 |
0.624 |
0.616 |
|
B |
0.573 |
0.566 |
0.584 |
0.574 |
|
本底 |
0.007 |
0.008 |
0.008 |
0.008 |
48h 570nm波長(zhǎng)各孔OD值：
|
實(shí)驗(yàn)分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.744 |
0.765 |
0.738 |
0.749 |
|
B |
0.636 |
0.663 |
0.657 |
0.652 |
|
本底 |
0.009 |
0.008 |
0.008 |
0.008 |
72h 570nm波長(zhǎng)各孔OD值：
|
實(shí)驗(yàn)分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.821 |
0.817 |
0.834 |
0.824 |
|
B |
0.701 |
0.724 |
0.695 |
0.707 |
|
本底 |
0.013 |
0.008 |
0.009 |
0.010 |
二、細(xì)胞粘附能力實(shí)驗(yàn)
試劑耗材及儀器設(shè)備：結(jié)晶紫染色液；1×PBS, 實(shí)驗(yàn)室常備，配方參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第二版》；儀器：美國(guó)bio-rad公司酶標(biāo)儀 #680
操作步驟:采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定。將Fn和Ln用1×PBS液分別稀釋成100μg/ml和200μg/ml，以每孔100μl分別包被96孔板；37℃包被2h，用1×PBS洗滌2次，再用1% BSA封閉2h。；將各組細(xì)胞按常規(guī)方法收集后用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3次取平均數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/ml，以每孔200μl加入包被好的培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2h；取出96孔板，輕輕洗去未粘附的細(xì)胞，每孔用100μl 4%中性甲醛固定，30分鐘后洗去；每孔加100μl 0.5%結(jié)晶紫，室溫染色2h,，蒸餾水洗滌一次，陰干后每孔加入100μl 2% SDS溶液，放置酶標(biāo)儀中570nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。
檢測(cè)結(jié)果：
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.586 |
0.563 |
0.592 |
0.580 |
|
B |
0.575 |
0.580 |
0.577 |
0.577 |
Fn OD值
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.649 |
0.633 |
0.654 |
0.645 |
|
B |
0.627 |
0.641 |
0.638 |
0.635 |
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.594 |
0.584 |
0.571 |
0.583 |
|
B |
0.546 |
0.543 |
0.558 |
0.549 |
Fn OD值
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.656 |
0.639 |
0.643 |
0.646 |
|
B |
0.609 |
0.611 |
0.603 |
0.608 |
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.602 |
0.591 |
0.603 |
0.599 |
|
B |
0.511 |
0.508 |
0.502 |
0.507 |
Fn OD值
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.671 |
0.665 |
0.653 |
0.663 |
|
B |
0.563 |
0.574 |
0.585 |
0.574 |
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.575 |
0.582 |
0.586 |
0.581 |
|
B |
0.474 |
0.463 |
0.481 |
0.473 |
Fn OD值
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.648 |
0.659 |
0.661 |
0.656 |
|
B |
0.521 |
0.516 |
0.534 |
0.524 |
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.569 |
0.573 |
0.568 |
0.570 |
|
B |
0.392 |
0.407 |
0.384 |
0.394 |
Fn OD值
|
分組 |
樣品 |
平行樣品 |
平行樣品 |
平均值 |
|
A |
0.636 |
0.641 |
0.652 |
0.643 |
|
B |
0.489 |
0.476 |
0.486 |
0.484 |
三、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)材料：Corning公司:Transwell6孔板，孔徑8um. BD公司:基底膜Matrigel
Transwell小室制備：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80μl，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。
制備細(xì)胞懸液：消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/ml。
接種細(xì)胞：6孔板下室加入1ml含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。上室加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)細(xì)胞。
結(jié)果統(tǒng)計(jì)：用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分鐘；
細(xì)胞計(jì)數(shù)：取5個(gè)視野于倒置顯微鏡觀察照相（放大倍數(shù)400）
A
平均107個(gè)細(xì)胞
平均66個(gè)細(xì)胞
平均98個(gè)細(xì)胞
平均54個(gè)細(xì)胞
平均103個(gè)細(xì)胞
平均61個(gè)細(xì)胞
四、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
材料：Corning公司:Transwell6孔板，孔徑8um.
制備細(xì)胞懸液：消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/ml。
接種細(xì)胞：6孔板下室加入1ml含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基；取細(xì)胞懸2ml加入Transwell小室；培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)24h。
結(jié)果統(tǒng)計(jì)：用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞；用95%酒精固定15-20min；HE染色10分鐘；細(xì)胞計(jì)數(shù)：取5個(gè)視野于倒置顯微鏡觀察照相（放大倍數(shù)400）
A
平均119個(gè)細(xì)胞
B
平均54個(gè)細(xì)胞
平均115個(gè)細(xì)胞
平均52個(gè)細(xì)胞
平均121個(gè)細(xì)胞
B
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