轉(zhuǎn)染(Transfection) ,是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。
轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。
一
轉(zhuǎn)染的類型
1)根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細胞的時間長短,可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。
2)根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué),生物,物理方法。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法簡單快捷且不需要其他儀器輔助的綜合考慮,一般是實驗室的??停越酉聛硐冉o大家介紹細胞轉(zhuǎn)染最常用的方法-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理和操作步驟。
二
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
脂質(zhì)體(Liposome)轉(zhuǎn)染方法原理
脂質(zhì)體作為體內(nèi)和體外輸送載體的工具,已經(jīng)研究的十分廣泛,中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA,借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體,DNA并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中,而是帶負電的DNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上,形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細胞。
優(yōu)點:
與其它方法相比,有較高的效率和較好的重復(fù)性,它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中,是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟
進行實驗之前,請先規(guī)劃好實驗,一般細胞轉(zhuǎn)染需要24h-72h,所以要充分了解細胞生長速度,計算所需脂質(zhì)體和DNA的儲備量,并確認準(zhǔn)備好所需試劑:Opti-MEM無血清培養(yǎng)基,Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑,以及DNA,這個一定要確認好。
1、細胞鋪板
(1)一般會選擇復(fù)蘇細胞傳代3-4次(匯合率達到90%之前對細胞進行傳代,不要長到100%),從解凍過程中恢復(fù)過來可以穩(wěn)定生長的細胞進行細胞轉(zhuǎn)染,傳代次數(shù)高(>30-40)時,細胞的生長速度和形態(tài)會改變。
(2)如果提總蛋白,一般選擇六孔板進行轉(zhuǎn)染,因為轉(zhuǎn)染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug,一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
(3)傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞,倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞,倍增時間為36小時(如原代細胞)。
(4)轉(zhuǎn)染當(dāng)天,將細胞鋪板。如果在轉(zhuǎn)染前一天或更早時間鋪板,轉(zhuǎn)染效率可能下降,如果是簡單細胞系的轉(zhuǎn)染,可以直接在前一天晚上鋪板,第二天來轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時,細胞密度會影響轉(zhuǎn)染效率,細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉(zhuǎn)染24h,如果轉(zhuǎn)染48h則需要匯合率為50-70%),細胞的鋪板和轉(zhuǎn)染也可同時進行。
2、細胞轉(zhuǎn)染
吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液,用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液:用200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加入至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。加入轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中,6h后,更換成完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質(zhì)粒和脂質(zhì)體最佳搭配比例不同,轉(zhuǎn)染前,應(yīng)該摸一個最佳配比。質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來檢測最佳轉(zhuǎn)染比例,一般質(zhì)粒有帶熒光,可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉(zhuǎn)染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。
轉(zhuǎn)染時,應(yīng)使用優(yōu)質(zhì)質(zhì)粒:
1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度,測得的OD值應(yīng)介于1.7-1.9之間。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。
2、含有內(nèi)毒素的質(zhì)粒對細胞有很大的毒性作用。
轉(zhuǎn)染時,小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻,避免粗暴用力吹打,會導(dǎo)致脂質(zhì)體失效。
血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率,老一代的轉(zhuǎn)染方法往往要求轉(zhuǎn)染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉(zhuǎn)染,但有些對此敏感的細胞會受到損傷,甚至死亡(比如貼壁較差的細胞,在PBS洗滌時很容易沖刷細胞)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率極低。不過轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天,對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說,血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率,甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,但是血清的存在會影響DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。轉(zhuǎn)染后6小時更換培養(yǎng)基,因為lipo2000具有一定毒性。
細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來預(yù)防污染,但是抗生素可能對轉(zhuǎn)染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素,青鏈霉素是我們常用來預(yù)防污染的抗生素,就會影響轉(zhuǎn)染,雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒,但當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑增加了細胞的通透性時,就會使抗生素也進入細胞從而間接導(dǎo)致細胞死亡,造成轉(zhuǎn)染效率低。目前轉(zhuǎn)染試劑有些已經(jīng)可以全程都用有血清和抗生素的完全培養(yǎng)基來操作,非常方便,省去了污染等麻煩。
3、觀察轉(zhuǎn)染的效果
在轉(zhuǎn)染后24小時,用熒光顯微鏡觀察實驗結(jié)果并記錄熒光蛋白表達情況,如下圖所示,說明轉(zhuǎn)染成功,且轉(zhuǎn)染效率還可以,如果不帶有熒光,可以用GFP來對照,可以放在一個單獨的孔中,或是與目標(biāo)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,同時用Q-PCR和者WB來檢測。
轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高,可以通過兩種方法:
1、復(fù)轉(zhuǎn)染,即轉(zhuǎn)染后12-24小時再次進行轉(zhuǎn)染,前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好,轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少。
2、通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。
我們提供蛋白表達服務(wù)
制備高質(zhì)量、高純度、天然保真性的蛋白,是許多實驗關(guān)鍵性的第一步。艾柏森生物致力于提供用于全球領(lǐng)先的蛋白質(zhì)表達和純化系統(tǒng)。作為蛋白與抗體制備服務(wù)高品質(zhì)供應(yīng)商,我們深刻領(lǐng)悟建立方便和易于使用的蛋白高表達和純化系統(tǒng)的重要性。為了使每一種交由我們完成的蛋白樣品都能找到最高效,同時最接近天然宿主的最優(yōu)表達體系,公司一方面從基礎(chǔ)材料入手,改進了一大批高效表達的分子工程載體并申請了專利技術(shù),另-方面,也建立了完善的各類蛋白表達體系,具體包括:
●細菌表達系統(tǒng)(大腸桿菌/芽孢桿菌)
●酵母表達系統(tǒng)(P酵母/ S酵母)
●桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)
●哺乳動物表達系統(tǒng)(CHO / 293)
●膜蛋白生產(chǎn)專利系統(tǒng)(新)
與同行相比,我們的技術(shù)優(yōu)勢在于:
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無細胞系統(tǒng)蛋白表達服務(wù)(Protein Expression in Cell-Free System)
服務(wù)簡介
無細胞表達系統(tǒng)是一種以外源DNA或mRNA為模板, 利用細胞抽提物中的細胞合成機器,白折疊銦子及其他相關(guān)酶系,通過添加氨基酸和T7聚合酶和能量物質(zhì)來實現(xiàn)蛋白表達的體外系統(tǒng)。中包括真核無細胞表達系統(tǒng)和原核無細胞表達系統(tǒng)。無細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢
更快得到數(shù)據(jù):僅需1小時即可獲得功能蛋白,而基于細胞的吊打系統(tǒng)則需要數(shù)天。
節(jié)省時間:表達蛋白可以直接用于后續(xù)實驗,不需要額外純化。
更適用于激酶等毒性蛋白的表達、也可使用經(jīng)過修飾的tRNA來進行標(biāo)記,在某特定位點摻入天然的氨基酸。
一個系統(tǒng),多重應(yīng)用:表達的蛋可于白-伯互作實驗;白核酸互作實驗,白修飾等多種特征分析。
艾柏森生物無細胞表達系統(tǒng)服務(wù)流程
●根據(jù)客戶的要求選擇合適的表達系統(tǒng)
●模板的設(shè)計與制備
●白達
●樣品分析(蛋白-蛋白相互作用、白-核酸相互作用、蛋白修飾)
●提交報告
客戶提供
目的蛋白的氨基酸序列、CDS序列
交付結(jié)果
完整的服務(wù)報告
目的蛋白
序號 | 最新資訊 | 瀏覽次數(shù) | 作者 | 發(fā)布時間 |
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2 | 安諾倫全國授權(quán)代理Enzyme Research Laboratories品牌產(chǎn)品 | 519 | 市場部 | 2022-12-28 |
3 | 安諾倫全國授權(quán)代理G-Biosciences品牌產(chǎn)品 | 827 | 市場部 | 2022-12-28 |
4 | 安諾倫代理ABP Biosciences品牌——專注于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的生物熒光試劑產(chǎn)品。 | 588 | 市場部 | 2022-04-24 |
5 | 好消息!安諾倫與Santa Cruz達成合作協(xié)議,我方已獲得授權(quán)! | 1342 | 市場部 | 2022-03-18 |
6 | 安諾倫代理Detroit R&D品牌——用于心血管疾病和癌癥的研究,診斷和治療 | 1416 | 市場部 | 2022-01-13 |