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> 資料中心 > 技術(shù)專(zhuān)欄 > 培養(yǎng)基與血清使用技術(shù)專(zhuān)欄 > ELISpot 常見(jiàn)問(wèn)題
1. ELISpot板你們推薦使用哪種？
答：我們推薦使用帶有PVDF膜并經(jīng)乙醇預(yù)處理的ELISpot板，它能有效結(jié)合足夠量的捕獲抗體。
2. 為什么ELISpot板包被前要經(jīng)乙醇預(yù)處理？
3. ELISpot板顏色很重要嗎？我應(yīng)該選擇白色還是透明的？
4. 怎樣用乙醇預(yù)處理ELISpot板？
5. 為什么ELISpot推薦的包被抗體濃度比ELISA高很多？
6. 什么類(lèi)型的細(xì)胞適合ELISpot分析？
7. 冷凍的細(xì)胞可以做ELISpot分析嗎？
8. ELISpot分析時(shí)每孔應(yīng)加多少細(xì)胞?
9. 我可以使用人血清做ELISpot分析嗎？
因?yàn)椋?/span>1.當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞因子時(shí)（例如IFN-γ）,血清中可能含有這個(gè)因子，它會(huì)和捕獲抗體和檢測(cè)抗體結(jié)合。2. 人血清中可能含有嗜異性抗體，它可以和任何物種的免疫球蛋白結(jié)合。
10. ALP和HRP結(jié)合物有什么不同？
11. ELISpot中我應(yīng)該使用哪種底物？
12. 為什么測(cè)試一天后TMB斑點(diǎn)變黃或幾乎消失了？
13. 為什么我在不加細(xì)胞的對(duì)照孔會(huì)看到非特異性斑點(diǎn)？
14. 你們有預(yù)期的ELISpot結(jié)果圖片供參考嗎？
https://www.mabtech.com/knowledge-center/assay-principles/elispot-assay-principle/elispot-images
15. 我可以使用ELISpot板做FluoroSpot嗎？
16. 實(shí)驗(yàn)完成后，最好多久讀FluoroSpot板？
因?yàn)?/span>ELISpot板膜是疏水性的，乙醇處理后使之變?yōu)橛H水性。親水性ELISpot板膜才可以結(jié)合足夠量的捕獲抗體，捕獲抗體量是否充足是得到高質(zhì)量斑點(diǎn)的前提條件。
白色和透明ELISpot板使用的都是PVDF膜，兩種顏色只是外管上有些不同，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有影響。
一般用乙醇短暫處理激活ELISpot板，預(yù)處理ELISpot板是非常關(guān)鍵的一步。不同的PVDF膜ELISpot板需要不同的預(yù)處理方法。
ELISpot板帶有PVDF膜，PVDF膜多孔結(jié)構(gòu)可結(jié)合大量捕獲抗體，可避免當(dāng)分泌蛋白出現(xiàn)局部高濃度時(shí)不至于檢測(cè)不到。捕獲抗體較少時(shí)容易出現(xiàn)弱的、分散的大片斑點(diǎn)，不利于結(jié)果評(píng)價(jià)。不同體系包被抗體量也會(huì)不同，但是一般包被抗體量為每孔1-1.5μg。ELISA板包被抗體大約是這個(gè)量的十分之一。
ELISpot 和FluoroSpot 可使用任何類(lèi)型的細(xì)胞。
冷凍儲(chǔ)存的細(xì)胞可以做ELISpot分析，但是結(jié)果取決于細(xì)胞質(zhì)量。
每孔細(xì)胞數(shù)量需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和預(yù)期的細(xì)胞分泌頻率而定。當(dāng)檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞時(shí)，外周單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量應(yīng)該不低于200000個(gè)/每孔。一般細(xì)胞不要高于500000個(gè)/每孔，會(huì)產(chǎn)生多層細(xì)胞，降低斑點(diǎn)質(zhì)量。
我們不推薦使用人血清做ELISpot分析。
ALP(堿性磷酸酶)和HRP(辣根過(guò)氧化物酶)是免疫分析中常用的酶。它們催化不同的反應(yīng)，需要不同的底物。ELISpot中兩種酶的靈敏性是一樣的，但是辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)更快速。
ELISpot需要沉淀型底物，ELISA底物不能用于ELISpot中，它不會(huì)產(chǎn)生斑點(diǎn)。我們推薦堿性磷酸酶使用BCIP/NBT-plus底物，辣根過(guò)氧化物酶使用TMB底物。
當(dāng)使用自來(lái)水洗板時(shí)，正常的藍(lán)色斑點(diǎn)可能會(huì)變成幾乎不可見(jiàn)的黃色，這是由水中離子化合物造成的。我們推薦實(shí)驗(yàn)時(shí)使用去離子水或蒸餾水。ALP酶和BCIP/NBT-plus底物不會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似的問(wèn)題。
非特異性斑點(diǎn)很少發(fā)生。一個(gè)原因是生物素化的抗體經(jīng)儲(chǔ)存后產(chǎn)生沉淀。另一個(gè)原因是污染或緩沖液中有灰塵。
通過(guò)以下網(wǎng)址可以看到預(yù)期結(jié)果圖片。
為了避免自發(fā)熒光，Millipore可提供低熒光PVDF膜板供使用。
FluoroSpot板在干燥和黑暗中熒光是非常穩(wěn)定的，可保存幾個(gè)月。但是我們推薦最好在實(shí)驗(yàn)完成后一周內(nèi)讀板。
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