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我們在做免疫熒光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡檢測（TUNEL）時(shí)，免不了要制備細(xì)胞爬片，爬片質(zhì)量完全決定了最后拍照的質(zhì)量以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。今天，就教大家如何制備好的細(xì)胞爬片。
一. 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
蓋玻片、培養(yǎng)板、酒精燈、鑷子等；75%乙醇、DMEM完全培養(yǎng)基（RPMI-1640完全培養(yǎng)基）、胰酶等。
二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容
爬片準(zhǔn)備：
1、24*24蓋玻片，剛好用于6孔板。也可用更大的蓋玻片，放在大的培養(yǎng)皿中爬片。
2. 蓋玻片泡酸過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時(shí)，再用三蒸水沖洗3遍（個(gè)人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒、烤干。
3．蓋玻片浸泡75%乙醇10分鐘消毒，然后酒精燈上烤干，直接放入培養(yǎng)皿，開始種細(xì)胞。重點(diǎn)是玻片是干凈的、無菌的。
4.蓋玻片在液體中經(jīng)常有貼壁吸附力，用一般鑷子很難一次性夾起，將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以。
細(xì)胞進(jìn)行爬片：
1. 胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中（懸浮細(xì)胞直接離心）。
2. 加細(xì)胞時(shí)，根據(jù)玻片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過程注意無菌操作。
3. 根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可
保存細(xì)胞爬片時(shí)，一般用培養(yǎng)皿或避光濕盒，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照沒有問題的。制備好的細(xì)胞爬片是不是很簡單呢？
三、注意事項(xiàng)
1. 使用細(xì)胞爬片時(shí)（比如在六孔板中放入爬片，六孔板的孔底面積往往會(huì)比爬片面積多出一部分，加細(xì)胞懸液時(shí)常常就是細(xì)胞鋪滿整個(gè)孔底，有時(shí)細(xì)胞生長邊集現(xiàn)象，就是靠近壁邊緣密度要高些，這樣處于中央玻片上爬的細(xì)胞數(shù)量就可能相對較少）。比較好的做法是將玻片放入孔板的孔內(nèi)后，加細(xì)胞懸液時(shí)只滴到玻片上，一直滴到液體布滿整個(gè)玻片又不會(huì)溢出玻片邊緣。
2. 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片。注意細(xì)胞不能太密，否則容易掉片。
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