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目前，藥用抗體的研發(fā)主要基于雜交瘤細(xì)胞或者體外抗體庫(kù)。通過(guò)抗原設(shè)計(jì)和抗體篩選，人們初步獲得陽(yáng)性的hits，再進(jìn)一步通過(guò)一系列生物性質(zhì)檢測(cè)和功能驗(yàn)證，終得到有藥用潛力的抗體。在實(shí)際研發(fā)過(guò)程中，經(jīng)過(guò)了常規(guī)篩選所得的抗體，有諸多方面需要更細(xì)致的改進(jìn)，包括親和力、免疫原性、半衰期等等，抗體領(lǐng)域這些年來(lái)做了很多相關(guān)的研究和實(shí)踐。其中，抗體親和力成熟是研究的重要方向之一。理論上，抗體親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力，有助于減少用藥劑量，降低毒副作用等。雖然實(shí)際的研究證明親和力的提高與抗體效價(jià)的提高并不總是線性的關(guān)系，尤其在實(shí)體瘤的治療上（可參考Weinstein的“binding site barrier”假說(shuō)[1]），但很多情況下，這個(gè)線性關(guān)系是明顯存在的。另外，發(fā)展抗體親和力成熟的技術(shù)，不僅有助于抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量改善，同時(shí)也有助于人們更好地理解抗體與靶點(diǎn)相互作用的機(jī)理，更好地認(rèn)識(shí)靶點(diǎn)的功能。

抗體親和力主要技術(shù)包括如下幾項(xiàng)：

1. 模擬體細(xì)胞高頻突變的抗體親和力成熟策略

BCR基因重排后的成熟B細(xì)胞受到抗原刺激后，會(huì)于生發(fā)中心發(fā)生重鏈和輕鏈V區(qū)的高頻率突變（主要是點(diǎn)突變），之后再經(jīng)過(guò)FDC捕獲抗原使表達(dá)高親和力BCR的B細(xì)胞免于凋亡。這一過(guò)程使得后代B細(xì)胞的BCR對(duì)抗原的平均親和力得到提升。這樣的體細(xì)胞高頻突變屬于二次免疫應(yīng)答，幫助可有效識(shí)別抗原的抗體進(jìn)一步成熟，有助于機(jī)體有效抵抗外來(lái)抗原的再次入侵。

抗體親和力成熟的策略之一，就是模擬體細(xì)胞高頻突變，通過(guò)細(xì)胞突變和展示抗體蛋白篩選對(duì)抗原高親和的抗體。原理如下圖：

1.1 基于B細(xì)胞系（人、雞等）高頻突變的篩選策略

Ramos是來(lái)源于人Burkitt淋巴瘤的一株細(xì)胞系，在培養(yǎng)過(guò)程中其重排后的免疫球蛋白V區(qū)基因持續(xù)發(fā)生組成型突變，并表達(dá)到膜表面。早在2002年Sarah等人就報(bào)道了利用Ramos細(xì)胞系篩選出對(duì)鏈霉親和素有高親和力的IgM。將鏈霉親和素結(jié)合到磁珠上，從一群Ramos細(xì)胞中篩出對(duì)鏈霉親和素有低親和力的細(xì)胞群，之后降低磁珠上的鏈霉親和素的密度以提高篩選的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩出親和力更高的突變。之后又進(jìn)一步用標(biāo)記FITC熒光的鏈霉親和素結(jié)合流式分選將抗體親和力進(jìn)一步提高。

隨后，他們對(duì)各批次的亞克隆細(xì)胞的V區(qū)基因做了序列比對(duì)，找出了突變位點(diǎn)，分析了抗體與靶點(diǎn)之間的構(gòu)效關(guān)系。

同在這篇文章中，他們還嘗試了使用XRCC2缺失的雞來(lái)源的B細(xì)胞系（DT40），篩選針對(duì)多個(gè)抗原的高親和力IgM。該細(xì)胞系同樣具有高頻率的V區(qū)基因組成型突變，并且比Ramos細(xì)胞系增殖時(shí)間更短。篩選結(jié)果顯示該細(xì)胞系也能實(shí)現(xiàn)IgM的親和力成熟。

以上兩個(gè)例子說(shuō)明合適的B細(xì)胞系可以作為工具細(xì)胞，用于抗體的親和力成熟。在具體應(yīng)用中，可以將特定的抗體模板基因插到細(xì)胞的免疫球蛋白基因位點(diǎn)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和高親和力細(xì)胞群的篩選。

1.2 基于其他細(xì)胞高頻突變的策略研究

基于體細(xì)胞高頻突變的抗體親和力成熟的開(kāi)發(fā)，主流方法均是基于B細(xì)胞系。B細(xì)胞系有其自身的不足，如基因操作比較困難、蛋白的翻譯后修飾特點(diǎn)不能滿(mǎn)足所有外源蛋白的要求等等。于是有實(shí)驗(yàn)室嘗試在非B細(xì)胞系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)親和篩選，以擴(kuò)充該技術(shù)的細(xì)胞系選擇面。

如中科院生物物理所杭海英課題組，向人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299中導(dǎo)入激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（AID），構(gòu)建H1299-AID穩(wěn)轉(zhuǎn)株，然后進(jìn)一步導(dǎo)入抗TNF-α的scFv基因并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株，得到的穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行培養(yǎng)和流式分選，獲取高親和力的scFv。

除此之外，還有基于非真核系統(tǒng)的篩選方法，如利用E. Coli的基因增變株來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體基因的高頻突變等等，其原理大同小異。

2. 基于抗體庫(kù)的親和力成熟策略

基于抗體庫(kù)的抗體親和力成熟與基于抗體庫(kù)的抗體篩選并無(wú)本質(zhì)差別，均為體外高親和力抗體篩選，重點(diǎn)仍是兩個(gè)方面，即庫(kù)的構(gòu)建和篩選系統(tǒng)的選擇。區(qū)別在于，后者所用的庫(kù)在構(gòu)建或合成時(shí)無(wú)偏向性或只具有針對(duì)某抗原的有限的偏向性；而前者所用的庫(kù)是基于確定的抗體序列模板所構(gòu)建的。

2.1 建庫(kù)策略

建庫(kù)的策略可分為兩個(gè)大的類(lèi)別：一類(lèi)是構(gòu)建較大的庫(kù)，將抗體CDR區(qū)域甚至整個(gè)V區(qū)做隨機(jī)突變；另一類(lèi)是構(gòu)建較小的庫(kù)，將突變集中于抗體序列上特定的區(qū)域。

大庫(kù)構(gòu)建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段隨機(jī)突變并保證相鄰兩個(gè)突變區(qū)域有所重疊，從而使突變覆蓋整個(gè)CDR區(qū)域；chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對(duì)重新洗牌，而DNA shuffling則是將抗體V區(qū)的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突變不限于CDR區(qū)，也包括FR區(qū)域，因?yàn)镕R區(qū)域?qū)τ诳贵w與抗原的結(jié)合也可能有所貢獻(xiàn)。這些方法所構(gòu)建的庫(kù)的容量較大，工作量也較大。

相比大庫(kù)的構(gòu)建，小庫(kù)構(gòu)建更有序列針對(duì)性。在沒(méi)有其他信息的情況下，人們習(xí)慣優(yōu)先選擇對(duì)抗體重鏈CDR3區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變，因?yàn)橹劓淐DR3區(qū)域被認(rèn)為通常對(duì)抗原抗體結(jié)合起關(guān)鍵作用；但若要真正提高親和力優(yōu)化的效率，還需要更多的信息以幫助人們找出更精確的突變區(qū)域。

目前突變區(qū)域的選擇主要是基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息或胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）的預(yù)測(cè)。

1）基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息的突變區(qū)域選擇

當(dāng)抗體抗原復(fù)合物的結(jié)構(gòu)被解析之后，我們就可以得知兩者相互作用的位點(diǎn)信息，進(jìn)而進(jìn)行更精確的突變和建庫(kù)。

MorphoSys AG2016年發(fā)的文章介紹了他們提高其自身的抗人GM-CSF抗體MOR103的親和力的工作。他們?cè)谥ぴ摽贵w與抗原的結(jié)合方式后，對(duì)抗體的CDR-H2和CDR-L3分別做隨機(jī)突變，并用噬菌體展示的方法篩選到高親和力的序列，之后再把篩到的重鏈與輕鏈配對(duì)，得到一個(gè)新的“cross-cloned”抗體:

體外GM-CSF和GM-CSFR結(jié)合的抑制實(shí)驗(yàn)比較了這4個(gè)抗體的效價(jià)。另外，他們還分別解析了這4個(gè)抗體與GM-CSF結(jié)合的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)并進(jìn)行比較，探討了構(gòu)效關(guān)系。

2）基于胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）的突變區(qū)域選擇

Germline hotspots是體細(xì)胞高頻突變過(guò)程中的優(yōu)先突變區(qū)域，幾乎都處于CDR區(qū)域內(nèi)部，經(jīng)證明對(duì)抗體的親和力提高起到關(guān)鍵作用，因此體外親和力成熟時(shí)可優(yōu)先考慮抗體的germlinehotspots。

具體的做法是利用數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)比對(duì)抗體的序列和抗體胚系基因序列，結(jié)合序列相似度和RGYW motifs等坐標(biāo)性的序列預(yù)測(cè)出germline hotspots，然后在這些熱點(diǎn)位置進(jìn)行突變，構(gòu)建小的庫(kù)進(jìn)行篩選。早在2009年，Ira Pastan課題組就發(fā)表protocol，以抗CD22的單抗為例，利用germline hotspots預(yù)測(cè)和噬菌體展示技術(shù)提高抗體的親和力[5]。

至于引入突變的方法，較簡(jiǎn)單的是易錯(cuò)PCR，但很難達(dá)到好的突變效果。另外一種比較流行的就是在引物上設(shè)計(jì)突變，即人工合成帶有突變區(qū)域的引物庫(kù)。具體的設(shè)計(jì)方法有很多，包括控制突變堿基的數(shù)目、控制每個(gè)位點(diǎn)各種堿基出現(xiàn)的概率等，以此來(lái)滿(mǎn)足對(duì)庫(kù)的容量和偏向性的需求。

2.2 篩選方法

基于庫(kù)的抗體親和力成熟與基于庫(kù)的抗體初步篩選涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等系統(tǒng)。

酵母展示技術(shù)

噬菌體展示的優(yōu)勢(shì)在于操作方便，流程相對(duì)簡(jiǎn)易；

酵母展示的優(yōu)勢(shì)在于與流式分選相結(jié)合，檢測(cè)和篩選同時(shí)進(jìn)行；

核糖體展示的優(yōu)勢(shì)是系統(tǒng)容量較大，可用于大庫(kù)的篩選，另外可以實(shí)現(xiàn)庫(kù)的體外進(jìn)化。這些技術(shù)各有優(yōu)劣，根據(jù)實(shí)際需要選擇使用。

技術(shù)介紹：

根據(jù)抗體親合力成熟的原理，在體外抗體親和力成熟的過(guò)程中，選擇突變區(qū)域以及如何引入突變是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，目前突變策略主要分三類(lèi)：隨機(jī)突變，隨機(jī)突變，置換和定向突變。

易錯(cuò)PCR：

易錯(cuò)PCR是目前常用的抗體突變技術(shù)，可以在抗體基因的全場(chǎng)或部分區(qū)域隨機(jī)引入突變；在聚合酶對(duì)目的基因擴(kuò)增時(shí)；通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件以及使用錯(cuò)錯(cuò)配率高的聚合酶等，以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，經(jīng)過(guò)PCR反復(fù)進(jìn)行進(jìn)行隨機(jī)誘變，累計(jì)突變效應(yīng)，終獲得目的蛋白的隨機(jī)蛋白突變體。

鏈置換：

保留某個(gè)特定抗體的輕鏈或重鏈，另一條鏈與一個(gè)隨機(jī)化的互補(bǔ)鏈進(jìn)行組合，從中篩選更高活性的突變株。通過(guò)固定抗體兩條鏈中的一條鏈，對(duì)另一條鏈構(gòu)建具有足夠多樣性的置換文庫(kù)。隨機(jī)組合有可能產(chǎn)生合適鏈組合，通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)篩選可獲得高親和力的抗體。

定點(diǎn)突變：

由于天然抗體在親和力成熟過(guò)程中，體細(xì)胞高頻突變發(fā)生區(qū)域并非均勻分布，而是主要集中在與抗原直接接觸的CDR區(qū)，在抗體的親和力體外成熟過(guò)程中，CDR去是常選用的定點(diǎn)突變區(qū)域，這樣既可以獲得足夠的祖列多樣性，又不會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)CDR進(jìn)行定點(diǎn)突變時(shí)，可以對(duì)多個(gè)CDR進(jìn)行平行突變或者逐步進(jìn)行優(yōu)化。

DNA改組：

DNA改組技術(shù)是對(duì)同源的抗體基因，采用脫氧核糖核苷酸酶Ⅰ將其切割成不超過(guò)50bp的片段，再隨機(jī)組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增成完整的抗體基因的技術(shù)，包含了抗體片段隨機(jī)化切割重組和篩選的過(guò)程，一定程度上模擬了天然抗體親和力成熟的過(guò)程，并加快了體外定向進(jìn)化速度。

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參考文獻(xiàn):

[1]Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: directexperimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research.

[2]Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitrousing hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology.

[3]Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFv with somatic hypermutation innon-B cells. Protein Cell.

[4]Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolutionof a neutralizing anti-human GM-CSF antibody.

[5]In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. MethodsMolBiol