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自從kohla和milsteinFTTC于1975年首創(chuàng)雜交瘤技術(shù)以來(lái)，單克隆抗體已應(yīng)用于免疫學(xué)、生理生化、藥理學(xué)、組織學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)等不同的學(xué)科，其應(yīng)用之廣、發(fā)展之快，促使醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域起著巨大的變革。單克隆抗體是利用細(xì)胞融合技術(shù)，在體外大量培養(yǎng)融合細(xì)胞，由融合細(xì)胞產(chǎn)生大量的抗體。由于單克隆抗體只識(shí)別某一特定的抗原決定簇，所以它具有特異性強(qiáng)、成分均一、靈敏度高、產(chǎn)量大、容易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而明顯優(yōu)于多克隆抗體。目前世界上己建立的單克隆抗體品種數(shù)以萬(wàn)計(jì)，其中數(shù)千種已經(jīng)上市.

免疫熒光技術(shù)又稱為熒光抗體染色方法，它是將血清學(xué)方法和顯微鏡示蹤方法結(jié)合起來(lái)的一種技術(shù)。這種技術(shù)是FTTCcoons等于1942FTTC年首先建立的，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究工作中的應(yīng)用將近FTTC%$FTTC多年。熒光抗體法是將特異性抗原多次注入動(dòng)物體，使之產(chǎn)生抗體，將免疫球蛋白從血清中分離出，用熒光色素標(biāo)記，制成熒光標(biāo)記抗體溶液，以該溶液作為特異性試劑，浸染含有特異性抗原（或抗體）的標(biāo)本，借異抗原抗體的特異性，于抗原或生物學(xué)染色方法有較高的特異性和敏感性。由于免疫化學(xué)技術(shù)的進(jìn)展和普及，熒光抗體染色法的應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大。對(duì)病原微生物的鑒定、血清抗體的檢測(cè)、特別是自身免疫病的研究、腫瘤免疫與診斷以及免疫球蛋白的代謝研究均有其優(yōu)越性。

為了使單克隆抗體所要認(rèn)識(shí)的目標(biāo)變成可見(jiàn)的診斷目標(biāo)，那就必須通過(guò)把放射性物質(zhì)、熒光素或酶分子引入抗體等化學(xué)修飾手段來(lái)達(dá)到目的。下面就對(duì)單克隆抗體和免疫熒光染色技術(shù)的原理、影響因素等方面進(jìn)行探討。

1. 基本原理FTTC

FTTC免疫動(dòng)物脾臟的淋巴細(xì)胞即FTTCB淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生特異性抗體，含有為抗免疫原抗體編碼的基因，但在體外培養(yǎng)條件下生存時(shí)間極短。而單個(gè)骨髓瘤細(xì)胞系雖可在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)生長(zhǎng)，含有提供無(wú)限繁殖和分泌免疫球蛋白能力的基因，但其產(chǎn)生的抗體卻不具有分泌特異性免疫球蛋白的能力。將這兩類細(xì)胞融合而產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，一方面具有骨髓瘤細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)的能力，另一方面又繼承了免疫淋巴細(xì)胞的功能，攜帶特異信息，從而大量合成特異性抗體。

由于細(xì)胞融合時(shí)，在融合劑聚乙二醇（789）的作用下，只有少數(shù)細(xì)胞融合而形成雜交瘤細(xì)胞，因此必須通過(guò)選擇性培養(yǎng)基將大量繁殖的未融合細(xì)胞分離出來(lái)，這就是篩選過(guò)程。由于每一個(gè)免疫淋巴細(xì)胞只能對(duì)單一的抗原決定基產(chǎn)生特異性抗體，因此將篩選出的融合細(xì)胞通過(guò)克隆化，使其集落生長(zhǎng)成為單克隆細(xì)胞系，就能產(chǎn)生大量單一的高純度抗體，這種抗體就稱為“單克隆抗體”。

1.2FTTC熒光是染料吸收一種波長(zhǎng)的光線，發(fā)出更大波長(zhǎng)的光線的物理學(xué)過(guò)程。處于基態(tài)的熒光色素受到紫外線或蘭紫外線光的照射而吸收足夠的能量，而使色素外層電子處于激發(fā)態(tài)。這種激發(fā)態(tài)電子給無(wú)輻射躍遷到第一能級(jí)后則隨著進(jìn)一步的輻射躍遷而回落到基態(tài)。在這輻射躍遷的同時(shí)釋放能量，以可見(jiàn)光的輻射形式釋放，這就是熒光。其特征能量（較激發(fā)光而言）小而波長(zhǎng)長(zhǎng)。這是由于部分能量以無(wú)輻射形式消耗的緣故，而波長(zhǎng)則與能量成反比。

3異硫氰酸熒光素（FITC）是目前最為廣泛應(yīng)用的熒光素。在堿性條件下，TITCFTTC分子上的異硫氰基—N=S=CFTTC能與抗體蛋白分子中的游離氨基（主要是賴氨酸的—NH2FTTC和少量的末端氨基）經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵，結(jié)合為熒光標(biāo)記抗體蛋白。1個(gè)分子的FTTCIgGFTTC有86個(gè)賴氨酸，但一般最多只能標(biāo)記15-20個(gè)。因?yàn)橹挥形促|(zhì)子化的自由氨基才能與FTTCTITCFTTC起加成反應(yīng)。在抗體側(cè)鏈游離氨基有賴氨酸的—NH2，谷氨酸的胍基，雜環(huán)氨基酸———FTTC組氨酸，脯氨酸和色氨酸。其中雜環(huán)氨基酸不易與FTTCTITCFTTC反應(yīng)，而谷氨酸的胍基解離常數(shù)（F&FTTC為FTTC!#5FTTC4C）較賴氨酸的—?:#FTTC為?。╬kFTTC為10.53"），所以質(zhì)子化的程度較賴氨酸為高，進(jìn)而不易與FTTCTITCFTTC反應(yīng)。

在偏堿性環(huán)境條件下賴氨酸之氨基部分未質(zhì)子化，呈-NH2FTTC狀態(tài)而易于進(jìn)行反應(yīng)。

抗體（免疫球蛋白）可以與熒光色素相結(jié)合，而不失其抗體的免疫活性，與熒光色素相結(jié)合的抗體稱為熒光抗體。

利用熒光檢測(cè)抗體的結(jié)合有兩種不同的方法。直接免疫熒光采用已直接以熒光染料標(biāo)記的抗體；而間接免疫熒光測(cè)定則是先將未標(biāo)記的抗體與細(xì)胞反應(yīng)，然后再用熒光染料標(biāo)記的抗抗體檢測(cè)這種結(jié)合的抗體。抗抗體通常稱為第二抗體，是以用于生產(chǎn)單克隆抗體動(dòng)物的免疫球蛋白免疫異種動(dòng)物制備的。當(dāng)用小鼠單克隆抗體進(jìn)行間接免疫熒光測(cè)定時(shí)，第二抗體可以是兔抗小鼠免疫球蛋白或山羊抗小鼠免疫球蛋白。

對(duì)于大多數(shù)用途來(lái)說(shuō)，間接免疫熒光與直接免疫熒光相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，尤其是僅用一種標(biāo)記的第二抗體即可檢測(cè)一系列小鼠單克隆抗體。間接法更為敏感，因?yàn)樵黾恿吮唤Y(jié)合分子的數(shù)量。但在某些特殊場(chǎng)合下，例如在雙標(biāo)志分析或第二抗體可能與靶細(xì)胞上的抗原交叉反應(yīng)時(shí)，則寧可采用直接免疫熒光法。

2FTTC主要影響因素

免疫熒光染色方法主要是檢查、鑒定、定位和示蹤各種抗原或抗體成分。所以對(duì)標(biāo)本的基本要求是抗原的形態(tài)變化盡可能地小，不溶解或不變性，原有位置不擴(kuò)散或不移位。因此，對(duì)標(biāo)本的處理一般速度要快、溫度要低，恒冷切片和涂片較為理想。此外，抗體溶液的FTTC-.FTTC和反應(yīng)溫度越低，孵育的時(shí)間越長(zhǎng)，一般37FTTC時(shí)需要15-20min。若要作細(xì)致觀察或者當(dāng)天不能進(jìn)行染色標(biāo)本的觀察，可在FTTC37FTTC中過(guò)夜，但染色標(biāo)本最好是當(dāng)天觀察。

2.1抗體FTTC與多克隆抗體（即常規(guī)血清）比較，單抗具有理化性質(zhì)的一致性。就是這種單抗的均一性，才體現(xiàn)出其應(yīng)用價(jià)值，但是也存在不利的方面。那就是：在標(biāo)記反應(yīng)過(guò)程中（包括純化過(guò)程），單抗的失活可能性遠(yuǎn)大于多抗的失活可能性。單抗愈純，愈易失活。均一的理化性質(zhì)，就必然引起標(biāo)記的均一性。由于抗體與FTTCFTTC的結(jié)合勢(shì)必引起抗體結(jié)構(gòu)的改變，特別是當(dāng)單抗多變區(qū)（屬FTTCNH2FTTC端的游離氨基）的結(jié)合，就顯然影響到抗體抗原的反應(yīng)，甚至使抗體完全失活。比如PRV-30-2（偽狂犬單抗）的標(biāo)記過(guò)程中，腹水純化液的FTTC

另外，必須采用飽和濃度的抗體，以便使熒光量受抗原密度限制，而不受單克隆抗體或第二抗體濃度的限制。通過(guò)預(yù)滴定幾個(gè)稀釋度的每一單克隆抗體或第二抗體（以肉眼或流動(dòng)式細(xì)胞計(jì)數(shù)器讀數(shù)）確定抗體的最適稀釋度。當(dāng)一個(gè)稀釋度呈現(xiàn)出比前一個(gè)稀釋度弱的熒光時(shí)，抗體便不再處于飽和狀態(tài)。為了防止該法固有的波動(dòng)，常規(guī)使用的濃度至少應(yīng)保證在FTTC#FTTC倍稀釋度時(shí)熒光強(qiáng)度亦不致減弱。高濃度的抗體（如腹水）有時(shí)呈現(xiàn)出前帶，這一術(shù)語(yǔ)用于高濃度的抗體產(chǎn)生陰性反應(yīng)，而稀釋的抗體呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)。在進(jìn)行免疫熒光測(cè)定中，由于有足夠的未結(jié)合的單克隆抗體與溶液中的標(biāo)記物反應(yīng)，從而阻斷了標(biāo)記物于結(jié)合與細(xì)胞的抗體反應(yīng)，可能會(huì)產(chǎn)生前帶。在這種情況下必需洗滌FTTC次。前帶可因更復(fù)雜的原因而產(chǎn)生，但在免疫熒光測(cè)定中不常見(jiàn)。

2.2 溫育時(shí)間和溫度 正像大多數(shù)結(jié)合—解離平衡一樣，低溫有助于結(jié)合，而高溫有利于解離。然而在較高溫度下更迅速地達(dá)到平衡。因此，獲得最大結(jié)合的良好方法是先在FTTC37溫育，然后將溫度降至7FTTC。然而，另一個(gè)對(duì)溫度選擇有影響的因素是抗體誘導(dǎo)的膜表面上的抗原移位，這種移位的形式多種多樣，如抗原斑片、抗原蓋帽、抗原的細(xì)胞攝粒作用及抗原脫落，最終可能是抗原丟失（抗原調(diào)整），顯然，這是應(yīng)當(dāng)避免的。在整個(gè)試驗(yàn)期間將細(xì)胞保持在4FTTC或加疊氮鈉，可將這些過(guò)程減少到最小限度。由于不能改變溫度以適應(yīng)不同親和性抗體的需要，可能不得不改變溫育時(shí)間。對(duì)于大多數(shù)抗體來(lái)說(shuō)，4溫育30min是適宜的，但在這樣的條件下，低親和性的抗體可能達(dá)不到平衡，因而需要更長(zhǎng)的溫育時(shí)間。

2.3FTTCPRV-30-2單抗的標(biāo)記過(guò)程主要是抗體賴氨酸的—氨基的反應(yīng)。其pk值為10.53，當(dāng)反應(yīng)PH愈靠近PK值，非質(zhì)子化的氨基就愈多，標(biāo)記上的FTTC就愈多，見(jiàn)表1：

特異性染色FTTC非特異性染色主要由于過(guò)度標(biāo)記所引起的，F(xiàn)TTC過(guò)多的結(jié)合，造成抗體結(jié)構(gòu)的改變，增加了空間位阻，而且，F(xiàn)TTC帶負(fù)電荷，而病毒的核酸蛋白多為堿性，在染色過(guò)程的FTTC-.FTTC均為中性而帶正電荷，進(jìn)而造成靜電引力的增加而出現(xiàn)非特異性的吸附。對(duì)于單抗而言，過(guò)度標(biāo)記物寧可棄之不用。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)表明

離子交換層析的流出物之F/P比變化不大，這也說(shuō)明單抗的理化一致性。

綜上所述，我們可以看到單克隆抗體熒光標(biāo)記技術(shù)將成為病毒診斷方面最為快速和準(zhǔn)確的方法之一。