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技術(shù)介紹：

X-射線分辨單克隆抗體-抗原復(fù)合物是分析單克隆抗體識別表位的最可靠方法，該方法基于對單克隆抗體-抗原共晶體衍射的X-射線束的強度和角度測量，再用生物信息學(xué)的方法確定原子坐標(biāo)，將復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)完整可視化。

抗原表位分析對抗體人源化改造，抗體親和力提高，抗體穩(wěn)定性改造，發(fā)現(xiàn)新的功能表位，改變抗體特異性，設(shè)計新抗體，基于抗原－抗體相互作用的立體構(gòu)型設(shè)計新型功能分子改造抗體都很重要。

應(yīng)用該方法首先需獲得純度較高的抗原、抗體，并使其相互作用形成共晶，但由于成本及技術(shù)要求較高，難以建立結(jié)晶條件，某些細(xì)菌或病毒蛋白產(chǎn)量過低等原因，此方法并未廣泛使用。

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生物物理技術(shù)在表位作圖中的應(yīng)用：

X-射線衍射、冷凍電鏡(cryo-EM)、核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)和表面等離子體共振(SPR)等生物物理技術(shù)在利用單抗的B細(xì)胞表位作圖研究中均發(fā)揮了重要作用。利用這些技術(shù)，不僅可以鑒定到構(gòu)象性B 細(xì)胞表位，也可以鑒定線性B細(xì)胞表位。抗原-單抗復(fù)合物的 X-射線晶體學(xué)分析是目前最準(zhǔn)確的B細(xì)胞表位鑒定方法。

它可以精確地確定抗原分子中與單抗發(fā)生相互作用的氨基酸殘基，甚至可以定位抗原上被單抗識別并結(jié)合的氨基酸殘基的主鏈或側(cè)鏈原子。不論被單抗識別的是構(gòu)象性B細(xì)胞表位，還是線性B細(xì)胞表位，都可以通過抗原-單抗復(fù)合物的X-射線晶體學(xué)分析得到解析。

由于抗原-單抗復(fù)合物的 X-射線晶體學(xué)分析涉及抗原和單抗的純化、抗原-單抗復(fù)合物的形成與純化以及復(fù)合物的晶體學(xué)解析等，需要專業(yè)技術(shù)和大量資金支持；這對于一些可溶性的簡單抗原來說就常常是一項難以完成的任務(wù)，而對于許多復(fù)雜抗原(如膜蛋白)而言則更加困難。因此，雖然目前已經(jīng)鑒定到成千上萬的單克隆抗體，但只有少數(shù) B 細(xì)胞表位通過抗原-抗體復(fù)合物的X-射線晶體學(xué)分析方法得到解析。

由于需要對樣品進行衍生和干燥，電子顯微鏡不適于研究抗原-單抗間的相互作用。但自2013 年冷凍電鏡技術(shù)的建立使電鏡技術(shù)研究抗原-單抗復(fù)合物的結(jié)構(gòu)成為可能。由于冷凍電鏡技術(shù)僅需要少量抗原-單抗復(fù)合物，不需要高純度蛋白，也不用對復(fù)合物進行結(jié)晶，可以用于分析其它方法(如X-射線晶體學(xué)技術(shù))無法解析的大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，因此，冷凍電鏡技術(shù)在表位作圖方面比 X-射線晶體學(xué)技術(shù)更具優(yōu)勢。

目前，冷凍電鏡技術(shù)常與X-射線晶體學(xué)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于B細(xì)胞表位作圖研究。單獨或與X-射線晶體學(xué)技術(shù)相結(jié)合，冷凍電鏡技術(shù)已經(jīng)用于 HIV、HPV 等病毒結(jié)構(gòu)蛋白的B細(xì)胞表位作圖研究。第三種應(yīng)用于利用單抗的B細(xì)胞表位作圖研究的生物物理技術(shù)是核磁共振技術(shù)。

核磁共振技術(shù)的分辨率恰好適合在原子水平解析抗原-抗體復(fù)合物中相互作用界面的結(jié)構(gòu)信息，即 B細(xì)胞表位鑒定。該方法通過分析抗原本身與抗原-單抗復(fù)合物核磁共振信號的差異，可以快速、準(zhǔn)確地確定抗原的B細(xì)胞表位氨基酸基序?；诤舜殴舱窦夹g(shù)的B 細(xì)胞表位作圖可以提供比突變體肽庫或肽庫篩選技術(shù)更詳細(xì)的表位信息，同時又比X-射線晶體學(xué)技術(shù)更加快速。但是，利用核磁共振技術(shù)解析抗原的B細(xì)胞表位需要首先確定抗原中每個氨基酸殘基的核磁共振信號，這對于大分子抗原來說是一個很大的挑戰(zhàn)。

核磁共振技術(shù)單獨或者與其他方法相結(jié)合已成功用于多種病原微生物結(jié)構(gòu)蛋白的 B細(xì)胞表位作圖研究。質(zhì)譜也以其快速的優(yōu)點而廣泛用于B細(xì)胞表位的鑒定。在該方法中，首先在抗體存在或不存在條件下，以蛋白酶酶解抗原蛋白，然后利用質(zhì)譜分析經(jīng)分離純化的酶切產(chǎn)物，從而確定被抗體保護的抗原蛋白的邊界(表位區(qū)域) 。

這種B細(xì)胞表位作圖方法的不足之處在于其只能鑒定到30?60個氨基酸殘基的表位片段，不能進行表位的精確定位。雖然氕/氘交換-質(zhì)譜技術(shù)提高了其表位作圖的精確度，但仍低于基于X-射線晶體學(xué)技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)的表位作圖方法的精確度。經(jīng)過 25 年的發(fā)展，隨著樣品處理技術(shù)的提高和先進質(zhì)譜儀的問世，基于質(zhì)譜技術(shù)的 B 細(xì)胞表位作圖所需的樣品量更低，可以在不降低準(zhǔn)確性的前提下分析更加復(fù)雜的抗原樣品。

基于質(zhì)譜技術(shù)的 B 細(xì)胞表位作圖方法不再僅限于利用單克隆抗體的表位鑒定，已經(jīng)擴展到利用多克隆抗體的 B 細(xì)胞表位作圖。表面等離子共振技術(shù)近年來迅速發(fā)展并應(yīng)用到生物分子相互作用的研究領(lǐng)域。該技術(shù)不僅具有無需標(biāo)記、特異性強、靈敏度高、樣品用量小的優(yōu)點，而且可實現(xiàn)在線連續(xù)實時檢測。

基于表面等離子共振技術(shù)的 B 細(xì)胞表位作圖類似于ELISA技術(shù)，雖然其B細(xì)胞表位作圖的分辨率低于基于 X-射線晶體學(xué)技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)的表位作圖方法的分辨率，但其可以快速、高通量地進行系列抗原突變體或片段與單抗的結(jié)合能力的分析。表面等離子共振技術(shù)單獨或與噬菌體展示技術(shù)等其它B細(xì)胞表位作圖技術(shù)結(jié)合已經(jīng)用于多種抗原分子的 B 細(xì)胞表位作圖研究。

綜上所述，基于生物物理技術(shù)的利用單抗的B細(xì)胞表位作圖雖然都可以進行B細(xì)胞表位鑒定，但這些方法都需要昂貴的儀器，有的還需要抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)信息或者需要專業(yè)技術(shù)人員的輔助才能完成。因此，X-射線晶體學(xué)技術(shù)、冷凍電鏡技術(shù)和核磁共振技術(shù)更多地用于重要病原的中和性單抗識別的B細(xì)胞表位鑒定，它們都是B細(xì)胞表位作圖方法的重要組成部分。

公司優(yōu)勢：

目前有幾種方法用于抗原表位的分析：X-射線晶體學(xué)、噬菌體呈遞展示隨機肽庫、LC-MS分析、3D-EM分析等；其中X-射線晶體衍射的方法是最精確的方法，通過抗原-抗體共結(jié)晶的方法可以精確到原子級別。

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